灵芝多糖对结直肠癌细胞的调控作用研究

刘伟志，洪 伟，李金龙

0 引言

结直肠癌(CRC)是全球常见癌症，是癌症相关死亡的主要原因[1-4]。结直肠癌在我国也是发病率较高的癌种，且发病率和死亡率呈逐年递增趋势[5]，因此，通过改善结直肠癌的治疗方案来降低结直肠癌患者的死亡率是目前的热点问题。

灵芝是我国著名的中草药之一，研究显示，灵芝具有抗肿瘤作用，在前列腺癌、肺癌和乳腺癌等不同类型的癌症中均被证实具有治疗和改善预后作用[6-11]。灵芝多糖是灵芝的重要活性成分，是从灵芝活性成分中分离纯化出的一种高分子化合物，是多糖与蛋白质的复合体[10-11]。临床研究显示，灵芝多糖同样对多种肿瘤细胞起到抑制作用，尤其是在乳腺癌治疗中效果明显[12]。最近有研究指出，灵芝多糖可能具有预防结直肠癌的作用[13-14]，但目前针对灵芝多糖对结直肠癌细胞的具体生物学功能影响的资料较少。

本研究分别经灵芝多糖和常用治疗药物卡培他滨作用于结直肠癌细胞，对比不做任何处理的结直肠癌细胞，检测灵芝多糖对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞凋亡的影响，以此探究灵芝多糖在结直肠癌中的具体作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 准备人结直肠癌细胞系T84(货号：BNCC100495)和DiFi(货号：BNCC339556)，购自北纳生物细胞库。分别置于Ham′S F12培养基和DMEM培养基的1∶1混合物培养基、含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱的实验环境中培养，每2 d传代1次，在本次实验中均使用培养的第4代细胞。

1.2 制备GLP 使用破碎机将灵芝制成粉末,经水浸泡24 h，然后进行冷碾压处理，对得到的碾压液进行层析，进而分离特定区间分子量的灵芝多糖。称量0.1 g灵芝多糖粉末,用100 ml超纯水溶解。于70 ℃下离心(300 r/min) 12 h后，经0.45 μm滤膜在砂芯过滤器中滤去不溶杂质，收集滤液，通过50 kD超滤管在6 400 r/min的转速下离心30 min。最后收集超滤管内浓缩药液，使用H051冷冻干燥器(LaboGene，Lynge，Denmark)进行冷冻干燥，获得用于后续实验的灵芝多糖。

1.3 MTT实验 选择处于对数生长期的T84和DiFi结直肠癌细胞，经胰蛋白酶常规消化后,加入培养基重悬细胞并调整细胞浓度为1×104个/ml，然后在每孔中接种200 μl的细胞悬液，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h，等到细胞贴壁后，根据试验要求分别设置空白组(即GLP和卡培他滨浓度为0的正常培养基)、GLP组、卡培他滨组3组，设置4个浓度梯度。在不同浓度梯度的GLP和卡培他滨作用24 h后，清除原培养基。加入新鲜培养基200 μl和10 μl MTT试剂，等待细胞贴壁2 h。于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入200 μl DMSO溶液，避光置于摇床10 min进行振荡混匀，经酶联免疫检测仪(Multiskan MK3，Thermo)在490 nm波长下检测各孔的OD值，实验重复3次。计算结直肠癌细胞存活率及对细胞增殖能力的影响。增殖抑制率=(1-处理组OD值/空白对照组OD值)×100%，细胞存活率=处理组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.4 划痕愈合实验 分为空白对照组、GLP组 (加入浓度为2 mg/ml GLP的培养基) 和卡培他滨组 (加入浓度为0.1 μmol/L卡培他滨的培养基)。器械进行常规灭菌，胰蛋白酶消化细胞后,将细胞浓度调整为4×105个/ml，然后取2 ml T84和DiFi结直肠癌细胞,分别和3组培养基作用24 h后接种于6孔板中，待细胞贴壁6 h后，弃去培养基。用100 μl无菌移液管枪头笔直刮擦其路径上的细胞，用PBS洗涤3次清除被刮擦下来的细胞。在0 h、24 h后，在显微镜下拍照，记录细胞划痕区域变化，并通过Image J计算细胞迁移率，细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。实验重复3次。

1.5 Transwell实验 实验分为空白对照组、GLP组 (加入浓度为5 mg/ml GLP的培养基) 和卡培他滨组 (加入浓度为50 nmol/L卡培他滨的培养基)。在Transwell小室中加入基质胶，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h，待基质胶凝固后吸去残余的液体，在上室中加入三组培养基培养24 h后的T84和DiFi结直肠癌细胞，胰酶消化后调整细胞密度为2×105个/孔，下室加入正常培养基。取出小室后，用湿润的棉签清除小室上室中残留的细胞，PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛固定30 min，经0.1%结晶紫染色细胞约20 min，PBS再洗涤3次。晾干后置于倒置显微镜下，每孔随机选择5个视野进行拍照并进行细胞计数。实验重复3次。

1.6 流式细胞术 分为空白对照组、GLP组(加入浓度为5 mg/ml GLP的培养基) 和卡培他滨组(加入浓度为50 nmol/L卡培他滨的培养基)，取处于对数生长期的T84和DiFi结直肠癌细胞，分别在3组培养基中培养24 h后接种于6孔板中，将细胞密度调整为2×105个/孔，等细胞贴壁4 h后去除原培养基，然后经不含EDTA的胰酶消化后，离心后用PBS清洗。根据FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)操作说明，用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC对细胞进行染色。加入1 ml稀释为1×的Binding Buffer，随后冲悬细胞并转移到流式管里，然后将PI和Annexin V-FITC(5 μl)加入细胞悬浮液(100 μl)中，室温下于避光条件下孵育15 min。离心5 min后弃上清液，加入5 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，并通过Guava EasyCyte流式细胞仪进行分析。

2 结果

2.1 灵芝多糖抑制结直肠癌细胞的增殖能力 MTT实验结果显示,不同浓度梯度的灵芝多糖和卡培他滨作用于T84和DiFi细胞时，相较于空白对照组，细胞在OD490nm的吸光值均显著降低(图1A)，指示结直肠癌细胞的增殖功能和细胞活力受到抑制，且随着灵芝多糖和卡培他滨浓度增加，对结直肠癌细胞的增殖抑制率也明显增加，细胞存活率降低(图1B-C)。即灵芝多糖和卡培他滨的效果相近，能够抑制结直肠癌细胞的增殖能力。

2.2 灵芝多糖抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力 划痕愈合实验结果显示，灵芝多糖或卡培他滨作用后，T84和DiFi细胞的迁移速率相比空白对照组显著降低(图2A)，提示结直肠癌细胞的迁移能力受到灵芝多糖或卡培他滨抑制；Transwell实验结果同样显示，经灵芝多糖或卡培他滨作用后的T84和DiFi细胞，其侵袭能力和空白对照组相比明显受到抑制(图2B)。结果显示，灵芝多糖能够抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。

图1 灵芝多糖抑制结直肠癌细胞的增殖能力

图2 灵芝多糖抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力

2.3 灵芝多糖促进结直肠癌细胞的凋亡 流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示，灵芝多糖或卡培他滨作用后的T84和DiFi细胞，细胞凋亡率显著高于空白对照组(图3)。结果显示，灵芝多糖和卡培他滨的作用相似，能够促进结直肠癌细胞的凋亡。

图3 灵芝多糖促进结直肠癌细胞的凋亡

3 讨论

结直肠癌是世界上最常见的癌症和癌症致死原因之一[15]，目前其主要治疗手段包括手术切除和化疗，然而由于疗效的有限性和器官毒性，这些疗法可能受到限制。寻找不良反应小的抑制结直肠癌细胞生长的天然化合物成为目前研究的热点。

最近研究显示，灵芝多糖具有抑制结直肠癌细胞活力的作用，可以通过Akt/ERK和MAPK/ERK信号通路诱导结直肠癌细胞的凋亡[16-17]。本研究显示，结直肠癌细胞T84和DiFi经灵芝多糖作用后，细胞凋亡率明显高于空白对照组，且与卡培他滨作用后的细胞凋亡率相近。即灵芝多糖可以诱导结直肠癌细胞的凋亡，且效果与卡培他滨差异无统计学意义，具有作为结直肠癌治疗中新型抑癌天然化合物的潜力。

此外，本研究结果显示，灵芝多糖作用后，结直肠癌细胞的增殖能力显著降低，随着灵芝多糖浓度的增加，对结直肠癌细胞的增殖抑制率呈上升趋势，结直肠癌细胞的活力不断下降，且灵芝多糖作用的总体趋势和卡培他滨相近；在对结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力影响上，灵芝多糖的抑制效果同样与卡培他滨相近。卡培他滨用于结直肠癌的治疗过程中，毒副作用较大，不良反应率较高[18]，而在灵芝多糖提取和使用方法逐渐成熟的情况下[19]，将灵芝多糖用于结直肠癌的治疗中具有一定的可行性。

综上所述，灵芝多糖对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力有抑制作用，促进结直肠癌细胞的凋亡，效果与卡培他滨接近，在结直肠癌治疗上具有潜力，具有研究前景。