异柠檬酸脱氢酶基因突变的弥漫性较低级别胶质瘤中α地中海贫血伴智力低下综合征基因缺失与1p/19q联合缺失的表达分析

王君祥 孙成法 褚荣涛 姜 华 龚铭杰 周幽心 李学涛

1.徐州医科大学附属常熟医院暨常熟市第二人民医院神经外科，江苏苏州215500；2.苏州大学第一附属医院神经外科，江苏苏州215006

胶质瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤，恶性程度不一。世界卫生组织最新的关于中枢神经系统的肿瘤分类将胶质瘤分为4级，其中多形性胶质母细胞瘤称为4级胶质瘤，恶性程度最高，而2～3级弥漫型胶质瘤（包括弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突胶质瘤和间变性少突胶质瘤）可称为弥漫型较低级别胶质瘤[1]。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突变能更好地评价类似组织学分型肿瘤的预后，但对于同样IDH分型的较低级别胶质瘤，利用相关基因变异如α地中海贫血伴智力低下综合征基因（X-linked alpha thalassemia mental retardation syndrome gene，ATRX）缺失或1号染色体短臂和19号染色体长臂（1p/19q）共缺失判断其亚型及预后的相关领域尚待深入研究[2-3]。

本研究的目的是评价ATRX缺失和1p/19q联合缺失在IDH突变的较低级别弥漫性胶质瘤患者中判断其亚型及评价其预后的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

IDH突变型成人较低级别弥漫性胶质瘤患者142例，选 自2012年6月 至2017年6月 确 诊并在苏州大学附属第一医院和常熟市第二人民医院手术及放化疗治疗的病例。其中平均随访时间40个 月（10～88个 月），男77例，女65例，年 龄30～62岁。包括弥漫性星形细胞瘤55例、间变性星形细胞瘤45例、少突胶质细胞瘤22例、间变性少突胶质细胞瘤20例，依据组织学分型分为星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤两组。组织病理学诊断符合2015WHO中枢神经系统肿瘤分类标准[2]。纳入标准：①成人初次发病；②术后病理确诊为弥漫型较低级别胶质瘤；③分子检测IDH阳性。排除标准：①复发性胶质瘤；②10个月内失访。本研究研究对象均知情同意并签署知情同意书，研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 胶质瘤ATRX缺失的检测

切片脱蜡后滴加ATRX多克隆抗体[Sigma-Aldrich公司（美国），HPA001906，1∶2000]，按照Envision二步法染色。阴性对照以缓冲液代替一抗进行孵育，细胞核棕褐色为阳性表达。免疫组织化学阳性判读标准：于每张切片挑选染色均匀5个不相邻高倍视野（×400），计数每视野内阳性细胞个数，并计算阳性细胞百分率。以ATRX阳性细胞数＞10%定义为阳性（ATRX表达），以阳性细胞数≤10%定义为阴性（ATRX表达缺失）[4]。所有试验都包括阳性对照样本及阴性对照以确保染色质量。

1.3 1p/19q联合缺失的荧光原位杂交（FISH）

FFPF切片上使用Abbott Molecular，Inc.的两组双色探针，探针组（A）：LSI 1p36（TP73/MEGF6，spectrum orange）/1q25（ANGPTL1/ABL2，spectrum green）；探 针 组B：LSI 19q13（ZNF44/ZNF443/MAN2B1，spectrum green）/19p13（GLTSCR2/CRX，spectrum orange）。每组探针计数200（200）个细胞，缺失1p或19q（1个红、2个绿信号）≥50%，或缺失1p36/1q25和19q13/19p13的信号比≤0.8，则提示1p或19q缺失[5]。

1.4 观察指标

①基于两组患者ATRX缺失与1p/19q缺失情况，比较其与组织学分型之间相关性。②术后第1年每3个月随访1次，随后每6个月随访1次，随访截止时间为2020年6月，平均随访时间40个月（10～88个月）。生存时间（OS）定义为诊断到患者死亡或最后1次随访之间的时间。比较两组患者中位生存时间与ATRX缺失及1p/19q联合缺失之间的关系。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0进行统计分析。计数资料采用χ2检验，评价各参数间相关性的显著性。Kaplan-Meier法估计生存率与ATRX缺失及1p/19q联合缺失之间的关系，采用log-rank检验进行评估。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IDH突变弥漫性低级别胶质瘤中ATRX缺失与1p/19q联合缺失患者情况

共检测142例成人IDH突变型弥漫性低级别胶质瘤患者，患者一般资料见表1。

表1 IDH突变弥漫性低级别胶质瘤中ATRX缺失与1p/19q联合缺失患者情况

2.2 两组ATRX表达缺失情况比较

免疫组织化学检测发现55.6%（79/142）的肿瘤患者有ATRX表达缺失。其中弥漫性星形细胞瘤43例，间变性星形细胞瘤35例，少突胶质细胞瘤1例。星形细胞瘤组中ATRX缺失显著高于少突胶质细胞瘤组，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.001），见表2及图1a、b。

表2 两组病例ATRX缺失情况比较[n（%）]

2.3 两组1p/19q联合缺失情况比较

FISH分析显示，22.5%（32/142）的肿瘤患者存在1p/19q联合缺失。其中少突胶质细胞瘤17例，间变性少突胶质细胞瘤15例。星形细胞瘤和间变星形细胞瘤未检测到1p/19q联合缺失。少突胶质细胞瘤组1p/19q联合缺失显著高于星形细胞瘤组，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.001），见表3及图1c、d、e、f。

表3 两组病例1p/19q联合缺失情况比较[n（%）]

图1 弥漫性低级别胶质瘤免疫组化及FISH结果（×400）注：a：星形细胞瘤，ATRX野生型；b：星形细胞瘤，ATRX缺失；c：星形细胞瘤，1p正常；d：少突胶质细胞瘤，1p缺失；e：星形细胞瘤，19q正常；f：少突胶质细胞瘤，19q缺失

2.4 ATRX缺失和1p/19q联合缺失对预后的影响

星形细胞瘤和间变性星形细胞瘤中，ATRX缺失的患者比野生型ATRX的患者生存时间更长，中位生存时间分别为46个月和40个月。同样，少突胶质细胞瘤患者和间变性少突胶质细胞瘤中1p/19联合缺失的患者预后明显优于1p/19q未缺失的患者，中位生存时间分别为53个月和42个月。差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2～3。

图2 弥漫性星形细胞瘤及间变性星形细胞瘤中不同ATRX表达患者的生存曲线

图3 少突胶质细胞瘤与间变性少突胶质细胞瘤中不同1p/19q表达患者的生存曲线

3 讨论

ATRX是SWI2/SNF2 DNA解旋酶家族中的一员，在染色质调控和端粒维护中发挥着重要作用[6]。ATRX突变与1p/19q联合缺失互斥，但与p53突变相关，提示ATRX可能驱动星形细胞瘤的谱系特异性形成[7]。在少突胶质细胞瘤中19q缺失及1p缺失较为常见，并且这些缺失经常同时发生[8]。1p和19q的缺失被认为是一个决定性的预测化疗反应和生存率的因素。目前认为1p/19q联合缺失是预后良好的相关因素[9]。

IDH突变已成为2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类中的独立分类因子[1]。既往研究表明，IDH突变在胶质瘤尤其是弥漫性较低级别胶质瘤中起重要作用[10]。而在IDH突变的弥漫性较低级别胶质瘤中，ATRX缺失或1p/19q联合缺失是否具有类似作用尚待进一步研究。本研究共检出79例ATRX缺失，绝大部分为星形细胞瘤，仅有1例为少突胶质细胞瘤。星形细胞瘤组中ATRX缺失率显著高于少突胶质细胞瘤组，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，本研究检出1p/19q联合缺失32例，均为少突胶质细胞瘤。少突胶质细胞瘤组1p/19q联合缺失率显著高于星形细胞瘤组，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明，上述基因突变具有较高的肿瘤特异性，可以用来鉴别星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。基于这些基因突变的分子进行分类可能比组织学分类更准确[11]。它们还可以用于纠正一些组织学分型中的一些误差。正如Kim等[12]所指出的，本研究中存在ATRX缺失的“少突胶质细胞瘤”更适合诊断为星形细胞瘤。

一些研究指出，具有IDH突变的弥漫性较低级别胶质瘤的疗效优于野生型的同级别胶质瘤[13-14]。但是同样IDH突变的患者，其预后影响因素尚待进一步研究。本研究表明，虽然发病年龄相近，ATRX缺失的较低级别星形细胞瘤患者的中位生存时间比ATRX野生型患者要长，中位生存时间分别为46个月和40个月，差异有统计学意义（P＜0.05）。这意味着在星形细胞瘤中，尽管组织学分型相似，ATRX缺失的肿瘤患者预后较ATRX野生型更优。类似的，在少突胶质细胞瘤患者中，尽管组织学分型相似，1p/19q联合缺失的肿瘤患者预后较1p/19q野生型更优，中位生存时间分别为53个月和42个月，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，在IDH突变的弥漫性较低级别胶质瘤中，即使肿瘤组织学分级不同，ATRX缺失和1p/19q联合缺失也可以作为这些肿瘤的独立预后因素。此外，如果对这些基因突变有快速的检测方法，针对这些肿瘤的综合治疗包括手术切除、放疗和化疗等，都可以得到更准确的治疗及评价手段。

已有研究指出基因靶向治疗对IDH突变的胶质瘤患者有良好的治疗效果[15]。针对ATRX和1p/19q的基因靶向治疗也有望在未来改善胶质瘤的预后。