免疫检查点B7-H3表位疫苗的设计及其抗肿瘤活性

夏雪霏，张 莉，罗建华，姚文兵，高向东，田 浤*

（1中国药科大学生命科学与技术学院江苏省生物药物成药性研究重点实验室，南京211198；2新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐830054）

B7-H3（也称CD276）是一种免疫检查点分子，属于B7超家族，在正常组织中广泛低表达，同时在多种恶性肿瘤中过表达，如黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌等［1］。在恶性组织中，B7-H3抑制肿瘤抗原特异性免疫反应，从而产生致癌作用［2］。此外，B7-H3还具有非免疫原发性肿瘤发生功能，例如促进肿瘤迁移和侵袭［3］。有研究表明，B7-H3的过度表达会持续地抑制人类T细胞反应［4］，尤其优先下调Th1型辅助细胞介导的免疫反应［5］；同时有研究显示，在人类肝细胞癌中，B7-H3通过诱导肿瘤相关巨噬细胞的M2型极化［6］，抑制炎症反应、促进血管生成，从而加速肿瘤进展［7-8］。还有研究表明，B7-H3分子可通过与NK细胞上表达的尚未确定的抑制性受体相互作用而保护肿瘤免受自然杀伤细胞的裂解［9］。因此尽管B7-H3的响应配体尚未发现，但肿瘤表面B7-H3的高表达会通过抑制Th1细胞、巨噬细胞、NK细胞的功能进而抑制抗肿瘤免疫活性，使B7-H3分子成为抗肿瘤药物设计的良好靶标。

目前针对B7-H3分子设计的药物如enoblitu‐zumab（MGA271）为单克隆抗体，在临床Ⅰ期阶段表现出了一定的抗肿瘤活性［10］。异种移植小鼠模型中，靶向B7-H3的CAR-T细胞在血液瘤和实体瘤中都产生明显治疗效果［11］。但抗体和CAR-T疗法均属于被动免疫治疗，存在给药剂量大、患者依从性差、不能产生持久免疫应答等问题。相较于被动免疫，主动免疫能够有效刺激机体免疫系统产生免疫应答［12］，并产生记忆性免疫细胞以维持长久疗效，防治肿瘤复发；产生多克隆抗体，防止抗原突变造成的免疫逃逸；同时抗原用量较小且给药次数少，可以提高患者用药依从性［13］，因此，开发针对B7-H3的疫苗具有良好的应用前景。

本研究以实验室前期设计的硝基化T细胞表位为基础［14］，用柔性肽将硝基化T表位与B7-H3分子胞外区B表位连接，构建了靶向B7-H3分子的表位疫苗［15］。B7-H3表位疫苗可以在小鼠体内诱导出高滴度特异性抗体，能有效抑制肿瘤生长，与PD-L1蛋白疫苗联用有明显的协同效应，并能有效改善肿瘤免疫抑制微环境。

1 材料

1.1试剂

3，3´，5，5´-四甲基联苯胺（TMB）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG（北京索莱宝科技有限公司）；小鼠脾脏淋巴细胞分离液、小鼠肿瘤淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清FBS（美国Gibco公司）；PE标记的抗小鼠CD3抗体、FITC标记的抗小鼠CD4抗体、APC标记的抗小鼠CD8抗体、PerCP/Cyanine5.5标记的抗小鼠IFN-γ抗体、PE标记的抗小鼠IL-4抗体、APC标记的抗小鼠CD25抗体、PE标记的抗小鼠Foxp3抗体（美国Bio‐legend公司）；固定破膜液、洗涤缓冲液（美国BD公司）。

多肽和佐剂均为南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2动物

BALB/c雌性小鼠（6～8周龄），SPF级，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（浙）2019-0001。所有动物实验均符合中国药科大学动物伦理委员会标准。

1.3 细胞株

小鼠结肠癌细胞株CT26（中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室保存）。

1.4仪器

恒温培养箱、高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；水平离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Countstar全自动细胞计数仪（上海泽权仪器设备有限公司）；AccuriC6 PLUS流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方法

2.1 B7-H3分子表位预测与肽疫苗设计

通过Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org）查询得到免疫检查点B7-H3分子胞外区氨基酸序列为：B7-H3（29~248）：VEVQVSEDPVVALVDT DATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSF TEGRDQGSAYSNRTALFPDLLVQGNASLRLQRVR VTDEGSYTCFVSIQDFDSAAVSLQVAAPYSKPSMT LEPNKDLRPGNMVTITCSSYQGYPEAEVFWKDGQ GVPLTGNVTTSQMANERGLFDVHSVLRVVLGAN GTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPLTFPPEA通过IEDB（http：//www.iedb.org）表 位 在 线 预 测 网站对免疫检查点分子B7-H3的B表位进行预测，并综合评价ParkerHydrophilicity、Chou&Fas‐manBeta-Turn、EminiSurfaceAccessibility、Karplus&SchulzFlexibility、BepipredLinearEpitope多 种B表位预测方法结果，综合考虑选择表位的氨基酸长度。用柔性肽将硝基化T表位与B7-H3分子胞外区B表位连接，构建靶向B7-H3分子的表位疫苗。所有多肽送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.2 ELISA法评价B7-H3肽疫苗免疫原性

2.2.1 动物分组及免疫方案 BALB/c小鼠随机分为3组：PBS组、2种不同氨基酸长度的表位疫苗组，每组6只，确保免疫前组间小鼠体质量不产生显著性差异。免疫方式：腹股沟皮下免疫，疫苗每只50µg，CpG佐剂每只10µg，每周1次，共3次。免疫后每周对小鼠进行眼底静脉丛取血，6 000 r/min离心20 min，分离上清液即为所需血清，对血清适当稀释后检测第1次免疫后第21和28天抗体滴度。

2.2.2 ELISA法检测血清抗体滴度 B7-H3多肽包被于酶标条中，37℃孵育2 h；PBST清洗液洗涤5次；加入封闭液，4℃孵育过夜；PBST清洗液洗涤5次。小鼠血清体积稀释12 800倍，作为一抗；37℃孵育2 h；PBST清洗液洗涤6次；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃孵育45 min；PBST清洗液洗涤6次；TMB显色，37℃避光孵育15 min。加入H2SO4终止；在450/630 nm波长的条件下检测吸收度。

2.3 B7-H3表位疫苗抑瘤效果评价

2.3.1 CT26结肠癌模型构建及动物分组 每只BALB/c小鼠于右前肢腋下处皮下注射5×105个CT26细胞，当肿瘤体积达到10 mm3左右时，取造模成功的小鼠，以肿瘤体积大小为标准按照区间随机分组的方法，将小鼠分为4组，每组6只，分别为PBS组、B7-H3-NitraTh组、PD-L1-NitraTh组、B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh联用组，确保分组时组间小鼠体重和肿瘤体积均不产生显著性差异，进行后续实验。

2.3.2 免疫方案 分组后的小鼠随即进行第1次免疫。PBS组、B7-H3-NitraTh组、PD-L1-NitraTh组、B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh联用组均与CpG佐剂联合免疫小鼠，免疫方式：皮下注射，单给药每次每只50µg，联合给药每种疫苗给药每次每只25µg，每周免疫1次，共免疫3次。每3天记录小鼠的体重和肿瘤体积。当肿瘤体积达到1 500 mm3时，处死小鼠，取小鼠脾脏、肿瘤、肝、肾进行后续实验。

2.4 B7-H3疫苗对小鼠脾脏T细胞亚群分化的影响

2.4.1 小鼠淋巴细胞的分离 处死小鼠，在75%乙醇中浸泡5~10 min，无菌条件下取出脾脏，并用PBS对脾脏进行清洗，使用2 mL注射器内芯研磨，研磨后组织通过70µm筛网；用PBS对细胞和筛网进行冲洗，转移至离心管中，430 r/min离心10 min。弃上清液，加入PBS 1 mL重悬；缓慢滴加细胞悬液至3 mL淋巴细胞分离液上层，保持淋巴细胞分离液与细胞悬液液面清晰分层；1 032 r/min离心20 min，小心吸取淋巴细胞层；加入PBS 8 mL，430 r/min离心5 min，弃上清液，重复1次；用PBS重悬细胞至浓度为每毫升5×106个备用。

2.4.2 流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞的分化情况 流式抗体标记：CD4+T细胞（PE标记的抗小鼠CD3抗体、FITC标记的抗小鼠CD4抗体）、CD8+T细胞（PE标记的抗小鼠CD3抗体、APC标记的抗小鼠CD8抗体）、Th1细胞（FITC标记的抗小鼠CD4抗体、PerCP/Cyanine5.5标记的抗小鼠IFN-γ抗体）、Th2细胞（FITC标记的抗小鼠CD4抗体、PE标记的抗小鼠IL-4抗体）。设置空染组、单染组作为校正，各实验组细胞分别标记PE标记的抗小鼠CD3抗体、FITC标记的抗小鼠CD4抗体、APC标记的抗小鼠CD8抗体，4℃孵育30 min。PBS重悬后602 r/min离心5 min，弃上清液。加入固定破膜液重悬细胞，4℃避光孵育20 min。加入洗涤缓冲液清洗两次，1 032 r/min离心5 min，弃上清液。标记PerCP/Cyanine5.5标记的抗小鼠IFN-γ抗体、PE标记的抗小鼠IL-4抗体，4℃避光孵育30 min。加入洗涤缓冲液清洗1次，1 032 r/min离心5 min，弃上清液。PBS重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测。

2.5 B7-H3疫苗对小鼠结肠癌肿瘤微环境的影响

2.5.1 肿瘤浸润淋巴细胞的获取 剪取适量大小的肿瘤样本（约1 g），用2 mL注射器内芯研磨，边研磨边加入PBS冲洗，使得肿瘤组织经过70µm筛网润洗至6孔板中。将细胞转移到15 mL离心管，按照体积比1∶1加入等量的淋巴细胞分离液。2 000 r/min离心15 min。将乳白色淋巴细胞层转移到新的15 mL离心管中，向离心管中加入10 mL PBS，2 000 r/min，15 min。弃上清液，用PBS重悬细胞至浓度为每毫升5×106个备用。

2.5.2 流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞情况流式抗体标记：CD4+T细胞（PE标记的抗小鼠CD3抗体、FITC标记的抗小鼠CD4抗体）、CD8+T细胞（PE标记的抗小鼠CD3抗体、APC标记的抗小鼠CD8抗体）、Treg细胞（FITC标记的抗小鼠CD4抗体、APC标记的抗小鼠CD25抗体、PE标记的抗小鼠Foxp3抗体）。设置空染组、单染组作为校正，各实验组细胞标记PE标记的抗小鼠CD3抗体、FITC标记的抗小鼠CD4抗体、APC标记的抗小鼠CD8抗体、APC标记的抗小鼠CD25抗体，4℃孵育30 min。PBS重悬后602 r/min离心5 min，弃上清液。加入固定破膜液重悬细胞，4℃避光孵育20 min。加入洗涤缓冲液清洗两次，1 032 r/min离心5 min，弃上清液。加入PE标记的抗小鼠Foxp3抗体，4℃避光孵育30 min。加入洗涤缓冲液清洗1次，1 032 r/min离心5 min，弃上清液。PBS重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测。

2.6 统计学分析

使用GraphPad Prism 7软件进行数据统计学分析，各项结果以xˉ±s表示。采用Student´s t-test对两组样本进行显著性比较，采用Two-Way ANO‐VA对受双因素影响的（肿瘤体积和小鼠体重）多组样本进行显著性比较，P＜0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 B7-H3表位疫苗的设计与筛选

B7-H3分子蛋白质胞外区预测得到的不同氨基酸长度的B表位序列如下：

B7-H3（B14）：FTEGRDQGSAYSNR；B7-H3（B20）：AAPYSKPSMTLEPNKDLRPG

通过柔性连接肽GPSL将预测的B7-H3蛋白分子胞外区B表位序列与通用硝基化T细胞表位（AKFVAAWTLKpNO2PheAA）序列连接，构建B7-H3表位肽疫苗候选分子。所有多肽送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的多肽表位疫苗氨基酸序列分别为：B7-H3（B14）+T（p NO2Phe）11：FTEGRDQGSAYSNRGPSLAKFVAAWTLK（p NO2Phe）AA；B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11：AAPYSKPSMTLEPNKDLRPGGPSLAKFVAAWTLK（p NO2Phe）AA。

为了筛选出免疫原性较高的多肽表位疫苗，用两种多肽表位疫苗分别免疫BALB/c小鼠，每周1次，共3次。取第1次免疫后第21、28天的小鼠血清，使用ELISA法检测抗体滴度。结果如图1-A所示，在第21天，2种多肽表位疫苗都可诱导产生特异性抗体。但是在第28天，B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11诱导产生特异性B7-H3抗体的能力显著 高于B7-H3（B14）+T（p NO2Phe）11（P＜0.001）（图1-A）。因此，选择B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11用于后续研究，以下简称为B7-H3-NitraTh表位疫苗。

对PBS组和经过3次疫苗免疫后的B7-H3-NitraTh疫苗组小鼠肝肾进行HE染色，结果显示，B7-H3-NitraTh表位疫苗组小鼠肝肾细胞形态无明显异常（图1-B）。

Figure 1 Immunogenicity of B7-H3 epitope vaccine（xˉ±s,n=6）A:Antibody titers produced by different B7H3 vaccines after immunizing mice;B:Liver and kidney HE staining of mice immunized with PBS and B7-H3-NitraTh(200×)*P＜0.05,**P＜0.01,****P＜0.000 1 v s PBS group

3.2 B7-H3-NitraTh疫苗的抗肿瘤活性评价

在BALB/c小鼠皮下构建CT26实体瘤模型，设置PBS组、B7-H3-NitraTh疫苗组，同时将B7-H3-NitraTh与实验室前期筛选得到的PD-L1-NitraTh蛋白疫苗联用，以期获得更好的抑瘤效果。结果如图2-B所示。相比于PBS对照组，B7-H3-NitraTh疫苗组可以显著抑制肿瘤体积增长（P＜0.001），而联用组相较于B7-H3-NitraTh疫苗组更能显著提高抑瘤效果（P＜0.001）。此外，小鼠体质量监测结果显示，各组间没有显著差异，疫苗的免疫没有引起明显的自身免疫相关不良反应（图2-C）。

Figure 2 Anti-tumor activity of B7-H3-NitraTh vaccine in mice with colon cancerA:Picture of the tumor removed from the sacrificed mice after the treatment(n=3);B:Mouse tumor volume growth curve measured after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine(xˉ±s,n=6);C:Curve of the weight change of mice measured after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine(xˉ±s,n=6)****P＜0.000 1 vs PBS group;####P＜0.000 1 v s B7-H3-NitraTh group

3.3 小鼠结肠癌模型中脾脏CD4+T细胞分化情况

为了探究肿瘤疫苗的作用机制，本实验首先检测脾脏中CD4+T细胞亚群的变化情况。流式细胞术结果显示，与PBS组相比，B7-H3-NitraTh组小鼠脾脏中CD3+CD4+T细胞比例有明显提升（P＜0.001），而相较于B7-H3-NitraTh或PD-L1-NitraTh单给药组，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh组脾脏中CD3+CD4+T细胞比例更是产生了显著性提高（图3-A）。同时与对照组相比，B7-H3-NitraTh与PDL1-NitraTh联用能显著性促进Th1（CD4+IFN-γ+T）细胞极化（图3-B），其Th1细胞的比例达到（2.18±0.39）%。这些结果表明，B7-H3-NitraTh疫苗可以促进脾脏中CD4+T细胞增殖，进而更好地辅助CD8+T细胞发挥肿瘤杀伤作用，且与PD-L1-NitraTh联用后能显著诱导Th0细胞朝Th1分化，分泌炎性细胞因子IFN-γ，促进抗肿瘤免疫反应的发生。

3.4 小鼠结肠癌模型中脾脏和肿瘤CD8+T细胞分化情况

研究疫苗治疗后对结肠癌小鼠的脾脏和肿瘤中CD8+T细胞亚群的影响，结果显示，脾脏中CD3+CD8+T细胞比例在B7-H3-NitraTh疫苗给药后显著高于对照组（P＜0.001）；将B7-H3-NitraTh疫苗与PD-L1-NitraTh疫苗联用后，脾脏中CD3+CD8+T细胞比例有了进一步的提升，与B7-H3-NitraTh或PD-L1-NitraTh单给药组相比产生显著性差异（P＜0.001）（图4-A）。对于肿瘤中浸润的CD3+CD8+T细胞比例，B7-H3-NitraTh疫苗单独给药后较PBS组有所提高（P＜0.05）；而两种疫苗联用后，脾脏中CD3+CD8+T细胞比例与对照组相比产生了更明显的提高，同时与B7-H3-NitraTh单给药组相比产生显著性差异（P＜0.01）（图4-B）。这些结果表明，B7-H3-NitraTh疫苗可以促进外周免疫器官和肿瘤浸润CD8+T细胞数量的增多，更好地发挥CTL效应，进而杀伤肿瘤细胞。

3.5 小鼠结肠癌模型肿瘤微环境Treg细胞变化

为了进一步探究B7-H3-NitraTh疫苗治疗后对免疫抑制性肿瘤微环境的影响，检测了肿瘤中Treg细胞的浸润情况。与PBS组相比，B7-H3-Ni‐traTh组可以明显减少抑制性Treg细胞的比例（P＜0.01），而相对于单给药组，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh联合给药又能进一步显著降低肿瘤中Treg细胞浸润，Treg细胞的比例达到（1.04±0.16）%（P＜0.001）。结果表明B7-H3-NitraTh疫苗可以减少肿瘤浸润的抑制性Treg细胞的比例，从而改善肿瘤免疫抑制微环境。

Figure 3 Differentiation of CD4+T cells in the spleen of mice with colon cancer（xˉ±s,n=3）A:Frequency of CD4+T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine;B:Frequency of Th1(CD4+IFN-γ+)T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine***P＜0.001,****P＜0.000 1 vs PBS group;##P＜0.01,####P＜0.000 1 vs B7-H3-NitraTh group;&&&P＜0.001 vs PD-L1-NitraTh group

Figure 4 Frequency of CD8+T cells in the spleen and tumor of mice with colon cancer（xˉ±s,n=3）A:Frequency of CD8+T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine;B:Frequency of CD8+T cells in the tumor after immuniza‐tion with B7-H3-NitraTh vaccine*P＜0.05,***P＜0.001,****P＜0.000 1 vs PBS group;##P＜0.01,####P＜0.000 1 vs B7-H3-NitraTh group;&&&P＜0.001 vs PD-L1-NitraTh group

Figure 5 Frequency of Treg cells in the tumor microenvironment of mice with colon cancer after immunization with B7H3 vaccine（xˉ±s,n=3）**P＜0.01,***P＜0.001 vs PBS group

4 讨 论

免疫检查点是治疗性肿瘤疫苗设计的良好靶点［16］，但是免疫检查点的B表位预测是其中一个难点。本研究使用的IEDB数据库是目前应用最广泛的表位数据库之一。此数据库收集了已经经过实验确定的T、B细胞表位以及主要组织相容性复合物，同时提供了Parker Hydrophilicity、Chou&Fasman Beta-Turn、Emini Surface Accessibility、Kar‐plus&Schulz Flexibility、Kolaskar&Tonqaokar Antiqenicity、Bepipred Linear Epitope等多种预测工具，分析亲水性、可及性、抗原性，并综合B表位长度筛选预测结果。

此外，考虑到免疫检查点是自身蛋白，存在免疫耐受，较低的免疫原性限制了疫苗的开发。而本课题组前期筛选得到一种硝基化通用Th表位，该表位可以和多种小鼠MHCⅡ类分子以及人的HLAⅡ类分子结合，打破MHC限制性［15］，同时借助免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸打破自身免疫耐受，经实验验证该硝基化T细胞表位可以辅助自体蛋白HER-2和PD-L1打破免疫耐受，诱导机体产生高滴度特异性抗体［17-18］。因此将B7-H3分子B表位预测序列通过柔性连接肽GPSL与硝基化通用T表位相连构成表位多肽疫苗免疫小鼠，结果显示两种不同氨基酸长度的表位疫苗均能刺激机体产生特异性抗体，一定程度上表明预测结果的准确性，提示未来可以通过此方法快速筛选得到蛋白分子B表位。但是相比于14个氨基酸长度的B7-H3（B14）+T（pNO2Phe）11，20个氨基酸长度B7-H3（B20）+T（pNO2Phe）11能够刺激机体产生更高滴度的特异性抗体，且随时间增加抗体滴度逐渐增高，证明其具有较强的免疫原性。因此，选择B7-H3-NitraTh表位疫苗用于后续研究。

临床前研究表明，免疫检查点的同时阻断可产生协同抗肿瘤效果［19］。因此尝试将具有一定抗肿瘤活性的B7-H3-NitraTh疫苗与实验室前期筛选得到的PD-L1蛋白疫苗联用，以期获得更好的抑瘤效果。结果显示，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh疫苗联合给药相较于B7-H3-NitraTh疫苗单给药可更加显著地抑制肿瘤生长。

通过检测脾脏中淋巴细胞变化情况探究肿瘤疫苗的作用机制，发现两种给药方式都在一定程度上刺激了T细胞活化并提高CD4+T细胞和CD8+T细胞比例。CD4+T细胞可与在抗原呈递细胞表面表达的MHC-Ⅱ反应而激活，激活的CD4+T细胞可分泌细胞因子来调节或协助免疫反应。同时发现，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh疫苗联合给药可显著提高Th1的比例，即诱导Th0细胞向Th1（CD4+IFN-γ+T）细胞方向极化。Th1细胞主要分泌炎性细胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、TNFβ等，介导细胞免疫反应，起到免疫杀伤作用；Th1细胞也可促进B细胞产生抗体、活化巨噬细胞、NK细胞和其他细胞毒性淋巴细胞，在激活免疫系统并清除肿瘤细胞中起到重要作用［20］。

实体肿瘤中浸润的效应T细胞，一定条件下可控制肿瘤的发展，临床研究表明，肿瘤组织高CD8+T细胞浸润与患者预后成正相关［21］，但同时肿瘤中也会有抑制性的调节性Treg细胞的浸润，Treg可抑制效应T细胞的功能进而促进肿瘤生长［22］。B7-H3-NitraTh疫苗可以增加肿瘤浸润CD8+T细胞的比例，同时减少肿瘤中抑制性Treg细胞的比例，提示可能存在使肿瘤浸润的抑制性Treg细胞转化为分泌IFN-γ的炎症细胞等相关机制［23］，从而改善肿瘤免疫抑制微环境，这需要后续进一步探究。

综上所述，本研究筛选得到的B7-H3表位疫苗可以产生高滴度特异性抗体，有效抑制肿瘤生长，并能增加肿瘤浸润CD8+T细胞的比例，同时减少肿瘤中抑制性Treg细胞的比例，改善肿瘤免疫抑制微环境，可以作为有效的肿瘤疫苗候选。并在与免疫检查点PD-L1疫苗联用后可以产生更好的抑瘤效果，促进Th1细胞极化，为不同免疫检查点阻断剂之间的联合给药提供参考。