血根碱与顺铂联用对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

石 达，雷崎方，陶 涛，马文龙，叶水仙，李广志，孙海燕，吴 松*

（1安徽理工大学医学院，淮南232000；2深圳大学附属第三医院，深圳518000；3深圳市众循精准医学研究院，深圳518000）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据WHO最新报道，全球膀胱癌每年新增病例约为74 000例，占所有新发肿瘤总数量的7%，病死率也在不断上升，占所有恶性肿瘤病死率的4%，其发病率和病死率在中国也呈逐年上升趋势［1-2］。手术切除及辅助化疗是当前膀胱癌普遍采用的治疗手段［3］。膀胱癌诊治指南中，推荐的一线治疗手段主要为基于顺铂（cisplatin）的化疗，但肿瘤的复发、治疗中的不良反应以及耐药的产生使膀胱癌患者5年生存率未见显著增长［4］。增强化疗敏感性，降低患者耐药以及改善化疗不良反应是当前膀胱癌治疗研究的热点，对提升膀胱癌患者的生存率及改善预后具有重要意义。

当前，已从中草药中发现大量对肿瘤有直接或间接抑制作用的天然产物，以此为先导开发新型化疗药物或治疗方式，极具潜力。血根碱（San‐guinarine）广泛存在于罂粟科（Papaveraceae）白屈菜族（Chelidoniaceae）植物中，是中药白屈菜（Cheli⁃donium majus）、博落回（Macleaya cordata）、血水草（Eomecon chionantha）等的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等作用［5-6］。近年来研究发现血根碱可能通过诱导肿瘤细胞死亡（凋亡、自噬），抑制侵袭、血管生成和上皮间质转化等过程，抑制乳腺癌、肺癌、结直肠癌等的发生、进展和转移［7］。然而，血根碱对膀胱癌的作用及机制研究鲜有报道，其作为新型化疗药物开发的潜力值得进一步挖掘。

本研究以人膀胱癌EJ细胞为研究对象，分别从细胞和动物水平，探讨血根碱及与顺铂联用促进膀胱癌EJ细胞凋亡，抑制肿瘤生长，为血根碱作为新型辅助化疗药物的开发以及膀胱癌的临床治疗提供参考和数据支撑。

1 材料

1.1 药品与试剂

血根碱（纯度≥98%，美国Chemfaces公司）；顺铂（纯度≥99%，美国Sigma公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液（美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒、Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京全式金生物科技公司）；细胞周期检测试剂盒（美国英杰公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；GAPDH抗体（中国Abclonal公司）；Bcl-2抗体（美国Santa公司）；羊抗鼠IgG（美国Thermo公司）；TUNEL试剂盒（瑞士Roche公司）。

1.2仪器

X3R台式高速大容量离心机、Multiskan Go1510全波长酶标仪（美国Thermo公司）；Ckx41倒置显微镜（日本Olympus公司）；FACS Calibur流式细胞分析仪（美国BD公司）。

1.3 细胞及动物

人膀胱癌EJ细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，并由本实验室长期保存。

SPF级BALB/c裸鼠，雌性，4~5周龄，40只，体重（15±3）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0006，所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1 细胞培养

EJ细胞中加入完全培养基（RPMI 1640培养基中加入10%FBS和1%双抗），于37℃5%CO2的培养箱中进行培养，每隔2天换一次液，细胞贴壁生长融合至80%左右时传代。细胞生长至对数期且状态良好时进行实验。

2.2 CCK-8检测细胞增殖

将细胞按每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板，设立8组不同浓度血根碱，依次为0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，12.8µmol/L，每组设3个复孔，处理细胞24 h和48 h，更换为含有10%CCK-8的培养基。孵育1.5 h后用酶标仪测量450 nm处的吸收度，计算各组EJ细胞活力和IC50。

2.3 Annexin V FITC/PI检测细胞凋亡

采用血根碱（3.0µmol/L）、顺铂（0.5µg/mL）和血根碱（1.5µmol/L）+顺铂（0.25µg/mL）以及PBS空白对照组分别处理膀胱癌EJ细胞24 h。收集细胞并用预冷PBS洗涤2次，将细胞悬浮于Annexin V缓冲液100µL中，设立单染和双染管分别加入PI及FITC（5µL），在室温下孵育30 min，再加入Annexin V缓冲液400µL，30 min内用流式细胞仪检测，FlowJo软件用于结果分析。

2.4 流式仪检测细胞周期

药物处理细胞方法同“2.3”项部分。收集药物处理过的细胞，采用细胞周期检测试剂盒处理样本，流式细胞仪检测分析，FlowJo软件用于结果分析。

2.5 血根碱联合顺铂对膀胱癌EJ细胞Bcl-2表达量的影响

处理细胞方法同“2.3”项部分。提取细胞总蛋白，制备蛋白样本，进行SDS-PAGE电泳，转膜后封闭2 h，TBST洗涤4次，每次5 min，一抗（Bcl-2抗体、GAPDH抗体）（所有抗体以1∶1 000稀释度使用）孵育4℃过夜，TBST洗涤后，使用相对应的二抗辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG（所有抗体以1∶1 000稀释度使用）孵育2 h，洗涤，化学发光显色成像，检测目的蛋白变化。

2.6 建模、分组、给药、药效和药物安全性评价

SPF级雌性BALB/c裸鼠40只，5只1笼，饲养与SPF实验室内，标准饲料和灭菌水随机取食。裸鼠随机分成4组，分为空白对照（生理盐水）组，血根碱（20 mg/kg）组，顺铂（5 mg/kg）组，血根碱（10 mg/kg）联合顺铂（2.5 mg/kg）组。每组10只，构建裸鼠皮下成瘤模型，在小鼠右侧腋下接种EJ细胞悬液125µL（每只1×107个细胞）。隔天1次测量肿瘤体积，V=（A×B2）/2，其中A为长，B为宽。待肿瘤长至50 mm3开始给药［8］。各组尾静脉注射相应药物200µL，每隔3天1次，共给药5次，末次给药后观察1周。（1）小鼠一般状态观察：实验过程中，隔日观察裸鼠的生存状态、精神、活动、进食、皮肤等一般情况。（2）抑瘤率检测：观察结束后（实验第33天）称量各组小鼠体重后，颈间离断法处死小鼠，剥离瘤块并称取瘤质量，计算抑瘤率。（3）称重：分离脾脏和肝脏并称取质量，计算脏器系数。（4）HE病理学检测：取新鲜肿瘤标本组织，以4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋，切片，常规HE染色，在倒置荧光显微镜下观察切片组织形态学改变。（5）肿瘤组织凋亡检测：收集新鲜肿瘤样品进行处理制成切片，使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测，判定组织凋亡情况。（6）标本制备：取新鲜心肝脾肺肾等重要脏器标本组织，以4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、常规HE染色，在倒置荧光显微镜下观察切片组织形态学改变，用于评估血根碱生物安全性。

2.7 统计学方法

采用SPSS17.0软件和GraphPad Prism7软件进行统计学分析，数据以xˉ±s表示，数据分析采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 血根碱对膀胱癌EJ细胞增殖的抑制作用

采用不同浓度的血根碱处理EJ细胞24和48 h后，CCK-8实验结果显示，与空白对照组相比，血根碱组处理EJ细胞后，能显著抑制细胞增殖（P＜0.05），且呈时间与剂量依赖关系（图1）。通过Graphpad软件计算得到血根碱组处理EJ细胞24和48 h的IC50分别为3.0和1.6µmol/L，并以此作为后续实验浓度的参考。

Figure 1 Sanguinarine（Sang）inhibits the cell viability of EJ bladder cancer cells(xˉ±s,n=3)

3.2 血根碱联合顺铂促进膀胱癌EJ细胞凋亡

Annexin V FITC/PI结果如图2-A和2-B所示，空白对照组凋亡细胞占比为（2.17±0.87）%，血根碱组凋亡细胞占比（16.83±4.62）%，顺铂组凋亡细胞占比（26.34±1.03）%，联合用药组凋亡细胞占比（37.07±4.02）%。与空白对照组相比，血根碱组凋亡细胞比例显著增加（P＜0.001），联合用药组和顺铂组凋亡比例具有显著差异（P＜0.001）。

Figure 2 Apoptosis rates of EJ cells in control,Sang,cisplatin(Cis)and combination group in 24 h(xˉ±s,n=3)A:Cell apoptosis of EJ cells in control(DMSO),Sang(3.0µmol/L),Cis(0.5µg/mL),and combination group were analyzed by flow cytometry.The dose of Sang and Cis was halved in the combination group;B:Apoptosis rates of control,Sang,Cis,and combination group***P＜0.001

3.3 血根碱联合顺铂对膀胱癌EJ细胞周期阻滞作用

流式仪检测细胞周期结果（图3）表明，在药物处理下EJ细胞周期发生显著变化。血根碱和顺铂可引起S和G2/M期阻滞，且联合用药组的G0/G1期细胞比例显著降低，S期和G2/M期细胞比例增加，说明联合用药组让细胞阻滞于G2/M期。

3.4 血根碱联合顺铂对膀胱癌EJ细胞Bcl-2表达量的影响

Western blot检测空白对照组、血根碱组、顺铂组及联合用药组的Bcl-2表达量。结果（图4）表明，与空白对照组相比，血根碱组Bcl-2表达量降低（P＜0.01），联合用药组的Bcl-2表达量显著降低（P＜0.001），说明联合用药组可经Bcl-2介导从而促进膀胱癌EJ细胞的凋亡。

3.5 血根碱联合顺铂用药对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用

实验前，全部裸鼠状态良好，体重无统计学差异，皮肤呈健康粉色，反应灵敏，饮食正常。肿瘤接种成功后，肿瘤体积逐渐增大，外观呈球状，首次给药体重各组间无差异。与空白对照组比较，顺铂组小鼠在实验第20天出现不良反应，表现为普遍精神萎靡不振、活动量减少、喜蜷卧聚集一团、皮肤偏白且粗糙少光泽、背部弓起、体重明显下降，个别出现眼皮肿胀等症状。在实验第28天血根碱组和联合用药组出现类似症状，但程度较轻，精神状态及活动力尚可，体重呈上涨趋势。给药期间，肿瘤体积生长曲线如图5-A所示，空白对照组、血根碱组、顺铂组与联合用药组肿瘤体积整体呈上涨趋势，血根碱组、联合用药组肿瘤体积与空白对照组相比有显著差异（P＜0.001）；顺铂组与联合用药组P=0.53，不具有统计学差异。5次给药后，血根碱组、顺铂组和联合用药组肿瘤体积和重量较空白对照组均减小（图5-B，5-C），空白对照组、血根碱组、顺铂组与联合用药组肿瘤质量分别为：（1.7±0.2）g，（1.1±0.2）g，（0.8±0.1）g，（0.5±0.2）g，其中血根碱组与空白对照组相比肿瘤质量有显著差异（P＜0.001）；联合用药组和顺铂组相比，肿瘤质量具有显著差异（P＜0.001）。各组抑瘤率分别为32.23%，54.82%和73.32%；联合用药组抑瘤率与顺铂组相比，具有显著差异（P＜0.001）（图5-D）。从肿瘤体积的生长变化曲线到肿瘤质量和抑瘤率可知，单独给药组和联合用药组对肿瘤有抑制作用，联合给药组抗肿瘤效果最显著。

Figure 3 Cell cycle of EJ cells in control（A）,Sang（B）,Cis（C）,and combination group（D）in 24 h analyzed by flow cytometry(xˉ±s,n=3)

Figure 4 Effects of control,Sang,Cis,and combination group on the protein levels of Bcl-2 in EJ cells(xˉ±s,n=10)A:Detection of protein level of Bcl-2 by Western blot;B:Quantitative analysis of protein levels of Bcl-2**P＜0.01,***P＜0.001

3.6 血根碱联合顺铂对肿瘤组织凋亡的影响

肿瘤组织经HE染色的病理结果如图6所示，空白对照组肿瘤细胞排列密集，细胞核明显，肿瘤细胞体积较大。联合用药组和空白对照组相比，肿瘤细胞密度降低，细胞核发生皱缩，细胞体积明显缩小。在TUNEL凋亡检测中，与空白对照组相比，联合用药组代表凋亡的绿色荧光信号增加，表明联合用药组诱导了更多的细胞凋亡。

3.7 血根碱联合顺铂对裸鼠皮下成瘤体内生物安全性评价

通过对小鼠主要脏器HE染色来评价血根碱组、顺铂组、联合给药组体内毒性变化（图7）。血根碱组、联合用药组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏没有明显的组织学损害。顺铂组小鼠肝脏和肾脏相比较于其他组有一定程度的损害。体内实验结果表明，血根碱组治疗膀胱癌裸鼠皮下成瘤小鼠具有良好的生物安全性。联合用药组能够缓解单独使用顺铂组带来的肝脏和肾脏的损伤，联合用药组能够降低单独使用顺铂组的不良反应，发挥减毒效果。

Figure 5 Effects of drug combination therapy on antitumor and synergia of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)A:Alterations of tumor volume in control,Sang,Cis and combination group;B:Anti-tumor effects of control,Sang,Cis,and combination group;C:Tumor weight of control,Sang,Cis,and combination group of mice;D:Tumor inhibition rates***P＜0.001

Figure 6 HE staining and TUNEL assay in tumor tissues of different treatment groups

3.8 血根碱联合顺铂用药对荷瘤小鼠的减毒作用

Figure 7 HE staining of major organs(heart,liver,spleen,lung,kidney)treated with different drug groups(black arrow pointed to the damaged area)

Figure 8 Effects of drug combination therapy on antitumor and attenuation toxicity effects of EJ tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)A:Alterations of mice body weight;B:Mice body weights;C:Mice spleen weights;D:Mice liver weightsns:not significant.*P＜0.05,***P＜0.001

如图8及表1所示，给药期间，血根碱组体重与空白对照组相比无显著差异，顺铂组体重与空白对照组相比，显著下降（P＜0.001），联合用药组体重与顺铂组相比具有显著差异（P＜0.001）。联合用药组对于顺铂组小鼠的体重降低情况有改善作用。如表2所示，血根碱组脾脏质量与空白对照组存在差异（P＜0.05）；联合用药组和顺铂组荷瘤小鼠脾脏质量差异显著（P＜0.001），血根碱组肝脏质量与空白对照组无显著差异，联合用药组肝脏质量与顺铂组相比具有显著差异（P＜0.001）。根据脏器系数公式分别计算出各组小鼠的脾脏系数和肝脏系数，联合用药组同顺铂组相比，脾脏系数具有统计学意义（P＜0.05）。其他组和空白对照组相比脾脏系数差异不显著，用药组和空白对照组的肝脏系数相比无显著差异。结果显示联合用药组对荷瘤小鼠脾脏具有一定的保护作用，对小鼠体重下降及生存状态具有改善作用。

Table 1 Effects of medication on EJ bladder cancer cells of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)

Table 2 Organ coefficient of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)

4 讨论

既往研究发现，顺铂通过进入细胞核作用于DNA分子，干扰DNA修复，导致DNA结构改变，发挥抗肿瘤作用［9］。血根碱可通过刺激氧化应激的产生诱导细胞凋亡，插入双链DNA抑制肿瘤细胞微管聚合等发挥抑制肿瘤生长的作用［10］。本研究发现，顺铂与血根碱联合用药后膀胱癌EJ细胞的G0/G1期细胞比例显著下降，S期和G2/M期细胞比例增加。由于G2/M期的周期检查点是细胞有丝分裂中的重要环节，只有没有受到损伤的DNA才能通过该点进入M期，否则可触发G2期阻滞，从而退出细胞周期，进入凋亡程序［11］。这提示，顺铂和血根碱的联合使用，可能通过对膀胱癌EJ细胞的DNA产生双重损害作用，让DNA损伤的肿瘤细胞更多阻滞于G2/M期从而促进了细胞凋亡。

Bcl-2基因是一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用。已有报道表明，Bcl-2在多种化疗药物的耐药细胞株中呈高表达［12］，通过降低Bcl-2基因表达，诱导细胞凋亡，对于克服化疗耐药具有重要价值。顺铂的耐药和不良反应是限制其临床应用的重要因素，本研究发现相对于单独使用顺铂组，顺铂与血根碱联合用药，膀胱癌EJ细胞的Bcl-2蛋白表达量呈显著下降，且对于荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制显著，重要脏器无明显病理损伤，这提示血根碱联合用药后，通过抑制原癌基因Bcl-2的表达，缓解顺铂耐药的发生。

同时，随着联合用药方案中，顺铂给药剂量的减少，可有效减轻顺铂不良反应对生存质量的影响。本研究中，对于荷瘤小鼠，联合用药组的生存质量较单独使用顺铂组有较为显著的改善，主要体现在体重的保持以及主要脏器损伤的保护，其中对荷瘤小鼠脾脏损伤的保护作用尤为明显。由于脾脏是免疫功能调节的重要器官，这提示本研究可以通过免疫功能及代谢功能评估进一步探索联合用药对顺铂不良反应减毒效果的可能作用机制，有望为膀胱癌临床化疗的改善提供参考。