CAR-T细胞免疫治疗实体瘤的研究进展

姚 铮，李子涵，高利明，胡 星，陈 颜，潘文琦，李 谦

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009）

随着肿瘤生物学和免疫学的发展，肿瘤免疫治疗已成为近年来肿瘤治疗领域的新途径［1］。表达抗原特异性的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的基因工程T细胞的过继转移（一种新型肿瘤免疫疗法），在治疗一些人类血液恶性肿瘤包括白血病和淋巴瘤方面已经取得显著成功［2］。单链可变抗原（single chain variable frag‐ment，scFv）和信号结构域的整合能够赋予CAR具有显著的特异性和细胞毒性，能够以不依赖人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的方式发挥活性。最初的CAR结构包含scFv和CD3ζ信号结构域，这使得T细胞具有短暂的激活和细胞毒性［3］。在一些研究和临床试验中，为了改善CAR-T细胞的细胞毒性和持久性，已经将共刺激信号分子，如CD28或CD137（4-1BB）整合到细胞内信号传导域中［4］。

在治疗血液瘤方面，特别是在急性淋巴细胞白血病中，CAR-T细胞免疫疗法尽管有很高的临床响应率，但CAR-T细胞的过继转移对实体瘤的治疗仍面临诸多挑战。从理论上讲，修饰的T细胞对肿瘤部位的归巢能力差，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）含有许多免疫抑制性细胞和其他免疫抑制因子（结构如图1所示）都会降低CAR-T细胞的细胞毒性。本文全面分析限制CART细胞治疗实体瘤的因素，介绍一些克服这些障碍的方法，对研究人员和医护人员有效对抗实体瘤具有一定的参考价值。

1 实体瘤肿瘤微环境中的障碍

1.1 物理屏障

TME中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），包括蛋白聚酶和糖肽酶，对肿瘤的生物学行为和免疫系统的重塑有多重作用。一些研究表明，ECM中的一些蛋白质是非结构基质蛋白，如硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），它们在维持肿瘤细胞增殖和迁移中起主要作用［5］。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤基质的主要成分。CAFs主要分布于血管周围或肿瘤外周纤维间质内，分泌细胞因子、ECM以及相关酶分子。肿瘤细胞与基质成分之间相互作用，形成了功能复杂的TME。T细胞在攻击基质丰富的实体瘤时几乎没有能力穿透肿瘤病灶部位，导致抗肿瘤活性的下降［6］。因此，提高工程化T细胞特异性降解富含基质的实体瘤中ECM而又不损害其细胞毒性，将显著增强抗肿瘤活性。

1.2 免疫抑制细胞和分泌的细胞因子

在TME中，免疫抑制主要由免疫抑制细胞介导：调节性T细胞（regulatory cells，Tregs），会减弱效应T细胞活性，促进TME的免疫抑制；骨髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），作为TME中的免疫负调控因素，能够抑制多种免疫细胞活性；M2型巨噬细胞，通过分泌辅助T细胞2（T helper 2，Th2）细胞因子促进血管生成和肿瘤侵袭。这些细胞在实体瘤内释放细胞因子如转化生长因子β（teansforming growth factor-β，TGF-β）和白细胞介素10（IL-10），这些组成与成分都将严重抑制回输的CAR-T细胞疗效。

1.2.1 Tregs Tregs在调节免疫应答中发挥重要作用，包括CD4+CD25+Tregs和Ⅰ型Tregs，生成与作用机制如图2所示。TGF-β对CD4+CD25+Tregs发挥功能至关重要，而Foxp3（叉头框蛋白P3）是其转录调节因子，在Tregs中高表达［7］。Ⅰ型Tregs通过分泌细胞因子IL-10发挥抑制活性。一般来说，Tregs在炎症和肿瘤部位富集，通过各种机制调节免疫反应。活化的Tregs可以通过快速吸收IL-2直接消除过多的T细胞，这导致缺乏足够的效应细胞抵抗恶性肿瘤。此外，这些抑制性细胞可以产生许多抑制T细胞活性的免疫调节因子，如TGF-β和IL-10，以此构成负调节循环，形成免疫抑制。

图2 Tregs生成与作用机制

1.2.2 MDSCs MDSCs是免疫抑制细胞的一个主要成分，负调节免疫反应，从而降低免疫系统的肿瘤免疫能力。MDSCs的负调控机制是通过诱导型一氧化氮酶、精氨酸酶催化酶Ⅰ、环氧合酶-2、前列腺素E2、TGF-β、IL-10和Tregs介导其抑制作用。另外，MDSCs的存在与肿瘤细胞的生长有关，在前列腺癌和结肠癌中，MDSCs产生活性氮，致使趋化因子CCL2（C-C chemokine ligand2，CCL2）发生硝化，抑制Th1（T helper 1，辅助T细胞1）型效应细胞的浸润。因此，抑制MDSCs功能已被证实可以改善TME中的抗肿瘤免疫反应［8］。靶向治疗MDSCs的免疫检查点c-Rel，可以明显改善小鼠黑色素瘤模型与淋巴瘤模型的肿瘤情况，肿瘤生长得到明显抑制［9］。因此，合理处理MDSCs可以有效提高肿瘤免疫活性。

1.2.3 肿瘤相关巨噬细胞 M2型巨噬细胞成为肿瘤相关性巨噬细胞（tumor associated macro‐phages，TAMs），通过表达可溶性蛋白和细胞因子（如IL-10、基质金属蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子等），在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中发挥作用。表达的IL-10能够有效地抑制细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的活化，最终导致肿瘤细胞的快速增殖。过量的M2型巨噬细胞释放特异性降解细胞外基质的基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9），从而促进了肿瘤细胞和肿瘤基质细胞的迁移，导致了肿瘤细胞更加难以被免疫细胞的追踪与杀伤［10］。此外，M2型巨噬细胞可以通过消耗L-氨基酸，产生促进肿瘤细胞增殖的鸟氨酸和多胺［11］。

1.3 免疫抑制性受体

1.3.1 CTLA4 通常机体内T细胞的活性通过激活信号途径和抑制信号途径来调节，最终导致健康人体内T细胞的活性平衡。通过抗原刺激信号和共刺激信号活化的T细胞能够快速增殖和功能分化。当T细胞过度活跃时，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated anti‐gen4，CTLA4）结合B7分子接到的抑制信号将终止T细胞的功能。CTLA4是CD28的同系物，对T细胞产生抑制信号，然后使其处于无活性状态。理论上，CTLA4募集磷酸酯酶到T细胞受体的CD3ζ结构域，从而通过免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的去磷酸化来减弱T细胞的功能。此外，一些研究已经证明，T细胞的T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）激活能够启动CTLA4胞内结构域的磷酸化，称为免疫受体酪氨酸抑制基序，同时也能够延长活化的T细胞表面CTLA4的表达［12］。基于CTLA4功能的原理，减少CTLA4内源性表达或抑制其活性可以用于肿瘤的免疫治疗。

1.3.2 PD-1 继CTLA4后肿瘤免疫治疗领域另一个重要免疫检查点是程序性死亡受体1（pro‐grammed death 1，PD-1），它是一种细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族，仅在活化的T淋巴细胞上表达。在结构上，成熟的PD-1蛋白包含细胞外识别结构域、跨膜区以及细胞内尾部。功能上，PD-1在抑制T细胞活性中起重要作用。具有两个磷酸化位点的尾部，一个ITM和一个基于免疫受体酪氨酸的转换基序，它们均负调节T细胞受体信号。如果肿瘤细胞激活PD-1，也会产生抑制信号，从而阻止效应T细胞的增殖，使T细胞不能及时有效地识别肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞逃避免疫细胞的追杀。基于CTLA4和PD-1在不同抑制途径中的功能，CTLA4抗体和PD-1抗体的联合治疗已经成为通过检查点抑制从而对抗肿瘤的有效方法［13］。

1.3.3 其他免疫检查点 尽管CTLA4和PD-1通路能够有效地负调节T淋巴细胞的免疫应答，但它们仅代表抑制抗肿瘤应答潜在靶点的“冰山一角”。随着肿瘤免疫治疗中T细胞的发展，随后又发现多种抑制免疫应答的免疫检查点，例如淋巴细胞激活基因3（lymphocyte-activation gene3，LAG3），T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cellimmunoglobulin mucin 3，TM3）和T细胞活化的V域Ig抑制剂（Vdomain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）。蛋白LAG3是一种细胞耗竭的标记，在激活的T细胞和其他免疫细胞上广泛表达，它是一种重要的抑制性受体，能够以比CD4更高的亲和力结合主要组织相容性复合体Ⅱ类（major histocompatibility complex class II，MHCⅡ），进而阻止抗肿瘤免疫反应。在T细胞上表达的受体蛋白TIM3可以启动TIM3/Galectin-9信号传导途径，其可以抑制淋巴细胞应答并促进细胞凋亡［14］。VISTA是一种在造血细胞和白细胞上表达的负调节受体，可降低T细胞的活性和细胞毒性细胞因子的产生［15］。

1.4 缺乏趋化因子受体

CAR-T细胞治疗实体瘤的主要障碍是T细胞难以渗入实体瘤组织内部。趋化因子是一类能够吸引白细胞到感染部位的蛋白质，介导多种免疫细胞进入肿瘤微环境，帮助T细胞进入肿瘤并影响肿瘤免疫和治疗效果。一些实体瘤能够分泌趋化因子，如趋化因子12（CXCL12）和趋化因子15（CXCL5），但肿瘤细胞抑制这些因子的分泌会不利于T细胞的渗透。相反，T细胞表面缺乏表达一些与实体瘤分泌的趋化因子相匹配的趋化因子受体［16］。一些报道显示，虽然实体瘤能够大量分泌趋化因子，如属于C-C趋化因子家族的CCL2，但是相应的趋化因子受体，如可特异性结合CCL2的CCR2b和CCR4，在T细胞上表达量很低，这导致T细胞归巢能力的降低。

1.5 肿瘤抗原不均一性

众所周知，CAR-T细胞通过scFv结构识别并靶向肿瘤细胞表面抗原，scFv由单克隆抗体的轻链和重链的可变结构域抗体组成。膜蛋白CD19在几乎所有的B细胞恶性肿瘤中均有广泛表达，这导致了CD19特异性CAR-T细胞的治疗效果令人鼓舞。然而，对于实体瘤，由于缺乏肿瘤特异性抗原以及肿瘤抗原的异质性，CAR-T细胞治疗的应用受到严重限制。目前进行临床试验的CAR-T靶点见表1。

表1 处于临床试验阶段的CAR-T实体瘤靶点

1.6 免疫系统中的其他免疫抑制因子

1.6.1 CD47 在人体免疫系统中，巨噬细胞基于靶细胞上吞噬信号（“吃我”）和抗吞噬信号（“不吃我”）之间的平衡发挥吞噬功能。抗吞噬信号取决于靶细胞上表达的CD47分子与巨噬细胞上呈递的信号调节蛋白α（signal regulatory proteinα，SIRPα）之间的相互作用，导致SIRPα的ITM磷酸化。跨膜蛋白CD47在许多肿瘤细胞中均过度表达［17］。通常CD47-SIRPα介导的抗吞噬细胞信号允许肿瘤细胞逃避免疫监视。因此，为了增强免疫系统应对肿瘤的能力，CD47可以用作肿瘤免疫治疗领域的新靶点。

1.6.2 CD73和腺苷 CAR-T细胞治疗实体瘤未取得成功很大程度上是由于腺苷的大量产生。腺苷由胞外腺苷一磷酸通过胞外酶催化产生，CD73在肿瘤细胞或免疫抑制性细胞上表达，有助于将具有免疫激活作用的ATP转化为腺苷［18］。产生的腺苷促进肿瘤生长和疾病发展，导致T细胞和NK细胞的细胞毒性被抑制，细胞因子的产生和增殖被抑制从而抑制抗原呈递细胞，促进Terg的增殖和抑制免疫活性，刺激MDSC和M2型巨噬细胞的极化［19］。

总之，在被抑制的免疫“监视”条件下，CAR修饰的T细胞会面临许多障碍。随着对肿瘤生物学和免疫学的进一步研究，科学家开发了一些策略克服这些障碍，使得对于实体瘤应用CAR-T成为可能。本文根据作用机制进一步描述了这些方法如何改善TME，进而增强T细胞功能。

2 提高CAR-T细胞功能的策略

2.1 选择肿瘤特异性抗原

CAR结构的抗原特异性直接决定了修饰T细胞的精确活性和安全性。然而，对于实体瘤，肿瘤抗原的异质性导致无效的免疫监视，从而导致难治性和复发性肿瘤。一些研究人员试图找到肿瘤干细胞的标志物，这些标志物在肿瘤分化的早期阶段被认为是肿瘤特异性抗原。有研究报道，生殖干细胞（POWIL2）异化激活产物（PL2L60）在各种血癌和实体癌瘤中广泛表达，介导肿瘤的发生发展，同时PIWIL2/PL2L60蛋白特异性单克隆抗体（克隆KAO3）可以抑制癌前干细胞在免疫缺陷小鼠内的致瘤能力，也能有效抑制多种肿瘤生长，包括淋巴瘤、乳腺瘤、肺癌和宫颈癌等［20］。鉴定肿瘤特异性抗原为开发用于实体瘤的靶向疗法提供了强有力的工具。

2.2 CAR-T细胞的浸润和归巢

2.2.1 趋化因子受体 为了增强T细胞对肿瘤的归巢能力，一些趋化性手段给予T细胞强大的靶向实体瘤的能力。肿瘤细胞分泌的趋化因子与修饰T细胞上的趋化因子受体相结合可促进更多的T细胞到达实体瘤部位。对于恶性胸膜间皮瘤，同时表达CCR2b和间皮素特异性CAR-T细胞可增加其迁移至肿瘤部位并消除靶细胞的能力。此外，其他研究小组也已经描述了类似的CAR方法，具有更强的运输和抗肿瘤效力，例如在治疗霍奇金淋巴瘤中使用表达CCR4的CD30特异性CAR-T细胞和在神经母细胞瘤中使用表达CCR2b的GD2特异性CAR-T细胞［21］。在这些研究中，用功能性趋化因子受体修饰的CAR-T细胞在体内具有显著的肿瘤定位和抗肿瘤效力。

2.2.2 成纤维细胞活化蛋白 先前的报道已经证明肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibro‐blasts，CAFs）能够促进血管生成，在实体瘤的进展和转移中发挥重要作用。因此，CAFs是肿瘤恶性进展的关键决定因素，是肿瘤治疗的重要目标。靶向CAFs是CAR-T治疗实体瘤的新方法。Schuberth等［22］利用CAR开发了一种特异性针对成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）的T细胞，FAP在CAFs上大量表达，在异种移植间皮瘤的动物模型试验结果中显示，FAPCAR-T治疗能显著提升生存时间，提高生存率。Wang等［23］研究表明，靶向FAP阳性细胞通过表位扩展增强抗肿瘤免疫活性。在小鼠间皮瘤与肺癌模型中，使用FAP-CAR治疗3 d后，内源性CD4+T细胞活化，随后内源性CD69+，CD8+T细胞浸润数量增加。使用CAF-CAR-T细胞进行的临床试验正在进行中（NCT01722149）。总之，靶向CAFs的治疗策略是根除肿瘤的有效方法。

2.2.3 整合素 对于实体瘤而言，修饰的T细胞缺乏浸润肿瘤实质的能力，导致其体内效力十分有限。一般而言，整合素αvβ3在实体瘤的新生血管内皮细胞表面高度表达，靶向整合素是可以解决T细胞缺乏浸润能力的问题。因此，Fu等［24］提出了一种很有发展前景的策略，即将T细胞植入能偶靶向αvβ3的含有echistatin的CAR（T-eCAR）。T-eCAR细胞的回输影响肿瘤新生血管系统，导致肿瘤显著缩小，但对正常组织的血管没有脱靶效应。一项基于靶向整合素β7的研究设计了MMG49 CAR特异性靶向整合素β7活性构象，该靶点在大多数骨髓瘤细胞表面表达且具有活性构象，体内实验结果表明，MMG49 CAR-T会特异性杀死小鼠体内的骨髓瘤细胞，具有显著的抗肿瘤活性且对正常细胞没有伤害［25］。

2.3 共表达免疫因子和酶

细胞因子是一种信号蛋白，具有显著增强或消除CAR-T细胞功能的能力。与免疫刺激细胞因子共同表达的CAR可显著提高免疫抑制性，例如IL-12可以调控T细胞多种T细胞的发育，对免疫反应的方向以及免疫相关疾病具有显著影响；IL-15在T细胞运输过程中起关键作用。同时为了进一步提升抵抗TME的能力，T细胞被改造以表达一些细胞因子，如IL-12或IL-15，并分泌一些酶，如过氧化氢酶等，结构如图3所示。

图3 共表达细胞因子的CAR-T结构

2.3.1 IL-12 免疫调节细胞因子IL-12能够促进免疫抑制的快速逆转，在T淋巴细胞和其他免疫细胞的活化中起重要作用，是抗肿瘤免疫的有效诱导剂。通过设计表达IL-12的CAR-T细胞可以作为改进CAR-T的新思路。Pegram等［26］报道，分泌IL-12的靶向CD19的CAR-T细胞能消除全身性肿瘤并获得最佳的抗肿瘤反应。另一个研究也显示，通过基因工程改造CAR-T细胞使其分泌微量IL-12，体内实验中，与4只未经治疗的小鼠相比，分泌IL-12的CAR-T细胞疗法显著提高了7只淋巴瘤小鼠的存活时间。另外，分泌IL-12的CAR-T细胞称为TRUCKs，不仅增强修饰T细胞的活化和细胞毒性，而且还导致Th1极化状态，吸引内源性T细胞和其他先天免疫细胞根除肿瘤细胞。

2.3.2 IL-15 一些研究表明，细胞因子IL-15通过结合IL2Rβγc复合物，能够有效增强记忆性CD8+T细胞和NK细胞的功能，而不激活具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细胞。通过设计表达IL-15的CAR-T细胞便可以增强免疫细胞的功能，改善突破肿瘤微环境。Chow等［27］证明IL-15在体内CD8+T细胞的运输中发挥重要作用。因此，表达IL-15的T细胞可以作为消除免疫抑制微环境中靶细胞的有效武器。有研究联合表达IL-15的CD19 CAR-T细胞疗法，比较CD19 CAR-T与IL15-CD19 CAR-T抗肿瘤能力，给予抗原刺激后，IL-15 CD19 CAR-T具有比CD19 CAR-T细胞更大的增殖能力，并且在异种移植淋巴瘤动物模型中，注射IL-15 CD19 CAR-T细胞的小鼠肿瘤消除更快，具有更强的肿瘤杀伤活性，且不对正常细胞进行杀伤［28］。上述研究证明了CAR-T细胞通过联合分泌IL-15可以增强CAR-T细胞的增殖能力提高抗肿瘤活性。

2.3.3 过氧化氢酶 在实体瘤中，浸润的T细胞经常会遇到丰富的活性氧，这是肿瘤微环境的一个标志，会损害修饰T细胞的抗肿瘤活性。保护T细胞免受氧化应激的一种方法是设计一种CAR-T细胞共同表达过氧化氢酶。Ligtenberg等［29］开发了一种新型T细胞模式（称为CAR-CAT-T细胞），具有共表达过氧化氢酶的CAR，其催化过氧化氢转化为水和氧，从而改善肿瘤微环境，提升免疫细胞的抗肿瘤活性。作者还在体外对癌胚抗原（CEA）和从表皮生长因子受体-2（HER2）CAR-T细胞进行了检测，发现与单纯CAR相比，此类CAR-T具有较低的氧化状态，并具有较好的增殖活力和细胞毒性。工程化的T细胞可以通过代谢过氧化氢和减少氧化应激介导的抑制来减少肿瘤的氧化状态，并保持其抗肿瘤活性。

2.3.4 HVEM(疱疹病毒侵入介体)疱疹病毒侵入介体（herpesvirus entry mediator，HVEM，图4），被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14（TNFRSF14），是中心淋巴瘤中最常见的突变基因，这些突变可破坏与BTLA（B and T lymphocyte attenuator，B、T淋巴细胞衰减因子）的抑制性受体之间的相互作用，通过恶化淋巴基质活化和增加滤泡辅助性T细胞的招募从而诱导淋巴细胞癌生长所需要的关键微环境。工程化T细胞可以携带HVEM从而阻止HVEM-BTLA作用被破坏。HVEM的丢失通常驱动中心淋巴瘤的发生并诱导肿瘤微环境。Boice等［30］设计携带可溶性HVEM的CD19特异性CAR-T细胞，通过释放可溶性HVEM在局部增强对淋巴瘤的治疗活性，携带HVEM的CD19 CAR-T具有更强大的抗肿瘤活性。这些研究结果也阐明了一种新方法，来修复肿瘤抑制性的HVEM-BTLA交互，并抑制了淋巴瘤细胞的生长。此外该方法也表明，CAR-T细胞不仅直接攻击肿瘤细胞，同时还具有精确治疗的药物传递工具。

图4 疱疹病毒侵入介体（HVEM）缺失机制

2.4 修饰一些相关受体

2.4.1 4-1BBL 最近的一些报道显示，第2代CAR组成型表达CD28配体或4-1BB配体（CD80或4-1BBL）可以增强体内T细胞活性，当4-1BB与4-1BBL或抗体激动剂结合，共刺激信号可促进T细胞的增殖和活化，并抑制活化诱导的细胞凋亡，进而增强T细胞的免疫杀伤功能。同时，诱导单核细胞等活化，促进细胞因子的分泌，使单核细胞、树突状细胞等在免疫调节中发挥作用。这可能以双向的方式在T细胞内直接传导信号，并间接触发TME中其他表达4-1BB的免疫细胞。在第2代CAR组成型表达4-1BBL的研究中，与正常的CD19 CAR-T相比，表达4-1BBL的CAR-T细胞在体内实验以最低剂量注射，且在回输CAR-T后一周便消除了肿瘤，显著优于CD19 CAR-T［31］。因此，共表达4-1BBL可称为CAR-T设计的一种有效思路。

2.4.2 CD40L 实体瘤的免疫治疗需要有效地破坏免疫抑制的肿瘤微环境。CD40-CD40L介导的信号能够诱导抗原呈递细胞的活化，增强对弱免疫原性肿瘤细胞抗原的呈递，从而诱导肿瘤特异性免疫。设计CAR-T细胞表达CD40L便可以激活该信号通路，增加其抗肿瘤活性。Marigo等［32］证实在树突状细胞分泌肿瘤坏死因子时，CD40/CD40L信号通路对与CD8+T细胞介导的肿瘤排斥是必须的，CD8+T细胞是有效抗肿瘤细胞免疫的核心。另外CD40分子与活化的T细胞表面CD40L相互作用，增强T细胞的细胞毒活性，增加细胞因子的释放，有效提高宿主的抗肿瘤免疫反应。因此，可以设想通过将CAR修饰T细胞与CD40-CD40L途径组合来实现肿瘤的消除。

2.4.3 DN TGF-βR Dominant-negative TGF-β受体（DN TGF-βR）是一类TGF-β的受体，可以结合TGF-β，从而减少TGF-β的量，进而减少免疫抑制效应。TME中存在许多由肿瘤细胞分泌的免疫抑制性细胞因子，包括显著抑制肿瘤特异性免疫的TGF-β。基于此机制，减少T细胞表面该受体的表达是克服TGF-β诱导免疫抑制的有效策略。Bol‐lard等［33］证明EBV特异性T细胞表达DN TGF-βR可以抑制TGF-B的抑制作用，从而延长T细胞存活时间，体内试验中，表达DN TGF-βR的CAR-T细胞在模型体内的存活时间明显优于正常的CAR-T细胞，从而提升CAR-T细胞在体内的作用时间，提升抗肿瘤活性。在临床试验NCT03089293涉及前列腺癌的治疗过程中，在前列腺特异性膜抗原靶向CAR载体中表达dominant-negative TGFβ受体，以减少TGF-β抑制T细胞的活性的作用。目前该临床试验还处于Ⅰ期。

2.5 阻断免疫检查点

先前的报道显示，实体瘤采用各种对策来削弱T细胞的细胞毒性，包括T细胞表达的免疫检查点。这些在活化的T细胞上表达的免疫性受体与表达在靶细胞上的配体具有高亲和力，有效抑制T细胞的效力。为了克服这一障碍，一些有效的技术已经出现，包括单克隆抗体（mAb）和基因编辑。对于mAb免疫疗法，与免疫检查点阻断相关的临床试验已经证明，mAb可以逆转T细胞耗竭并恢复抗肿瘤免疫性，如抗PD-1的mAb，抗LAG3的mAb和抗BISTA的mAb。

CRISPR/Cas9技术开发了破坏免疫检查点来重新编程T细胞的非病毒方法。Su等证明通过电转染编码sgRNA和Cas9的治理来敲除T细胞的PD-1，导致PD-1表达的显著降低，细胞毒性显著增强。Gao等［34］证明利用CRISPR/Cas9系统敲除CTLA4的细胞毒性T细胞能够抑制肿瘤生长并促进肿瘤根除。因此，包括CAR-T细胞和检查点阻断在哪的一体化方法有助于提高T细胞的功效。

为了逆转PDL-1介导的T细胞耗竭，Prosser等［35］提供了一种新策略，通过将PD-1的跨膜和胞内域与CD28进行交换，从而将PD-1转化为T细胞共刺激受体。研究表明，肿瘤PDL1能够显著刺激表达PD-1，CD28嵌合受体的T细胞，导致细胞因子分泌增加并增加细胞毒性。

3 应用前景

CAR-T细胞疗法在一些针对血液恶性肿瘤的临床试验中取得巨大成功，为治疗富含免疫抑制因子的实体瘤提供了一种可行的方案。最近几年，免疫抑制环境的特征已经详细阐明，提出了一些能够让CAR-T细胞克服这些障碍和增强肿瘤消除的新方法。有研究报道联合使用特殊设计的分子佐剂可以增强CAR-T的杀伤活性，也为探索CAR-T的实体瘤治疗提供了新的思路与方向［36］。借鉴于CAR-T治疗实体瘤的研究，在抗衰老方面CAR-T的应用也加速进行，近些年就有多篇报道关于CAR-T抗衰老研究，主要是应用于直接对抗衰老细胞［37］，其基础也是基于CAR-T的实体瘤治疗。本文概述了实体瘤TME对免疫监视的抑制机制，并探讨了通过优化CAR结构和改善肿瘤诱导的免疫抑制环境来增强CAR-T细胞功效的一些有前景的方法。为了增强CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效，通过修饰T细胞以维持细胞毒性，同时通过重塑改善实体瘤肿瘤微环境以增强效应细胞的疗效，以此来达到CAR-T细胞治疗实体肿瘤的目的。