东莨菪碱长期给药致小鼠学习记忆障碍模型及机制研究

刘淑青 顾丰华

【摘要】目的：考察東莨菪碱长期给药后对小鼠学习记忆功能的影响，探究东莨菪碱长期给药致小鼠学习记忆障碍模型的剂量效应关系及对神经再生和氧化损伤的作用。方法：ICR雄性小鼠，随机分为空白对照组、14天造模组和14天持续造模组。造模组分别腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。通过Morris水迷宫实验、跳台实验检测小鼠学习记忆能力，BrdU+DCX染色检测小鼠脑神经元增殖分化情况，考察脑内乙酰胆碱酯酶（AChE）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量变化。结果：东莨菪碱长期给药后可延长小鼠找寻水迷宫平台潜伏期，减少穿越平台次数，降低目标象限停留时间；减少跳台潜伏期，增加错误次数；可影响小鼠BrdU+DCX阳性细胞数；改变AChE、SOD活性及MDA含量；有剂量-效应关系。结论：东莨菪碱长期给药后可造成一定程度小鼠学习记忆功能障碍，且长期给药可致神经细胞损伤，其作用机制可能与神经细胞再生障碍和氧化损伤有关。

【关键词】东莨菪碱；Morris水迷宫实验；免疫荧光染色

中图分类号：R-332

文献标识码：A

文章编号：2096-5249（2021）02-0001-06

Model and mechanism of scopolamine induced learning and memory impairment in mice

LIU Shu-qing1，2 GU Feng-hua1，2△

1.State Key Laboratory of &New Drug Pharmaceutical Process， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200437， China

2. Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation， Shanghai 200437，China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of scopolamine on learning and memory function of mice after long-term administration and explore the dose-effect relationship of long-term administration of scopolamine，as well as the effects on nerve regeneration and oxidative damage.Methods：Male ICR mice were randomly divided into a blank control group，a 14-day model group and a 14-day continuous model group. The model group was scopolamine by intraperitoneal injection at the doses of 1，2 and 4 mg/kg，and the blank control group was given the same volume of saline.Learning and memory ability of mice were investigated by Morris water maze experiment and diving platform experiment，and the proliferation and differentiation of brain neurons were detected by BrdU+DCX staining，and cholinesterase（AChE），superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content of brain were investigated.Results：Continuous administration of scopolamine could prolong the incubation period of finding the water maze platform，reduce the number of crossing the platform，and reduce the residence time of the target quadrant.And reduce the diving platform incubation period，increase the number of errors.The number of BrdU+DCX positive cells in mice was affected.AChE，SOD activity and MDA content were changed.There is a dose-effect relationship.Conclusion：Scopolamine can cause learning and memory dysfunction and nerve cell damage in mice after long-term，the mechanism of which may be related to nerve cell regeneration disorder and oxidative damage.

【Key words】scopolamine；Morris water maze experiment；Immunofluorescence staining

东莨菪碱作为M胆碱受体阻断药，与多种亚型M受体有相似的亲和力，能阻碍乙酰胆碱与脑内M受体的结合，主要作用于记忆的获取阶段，从而影响信息的传递，导致学习记忆功能受损[ 1 ]，与部分老年鼠的学习记忆损伤存在相同的作用机制[ 2 ]，可作为老年性痴呆症造模方法之一。研究证明，东莨菪碱单次给药作为学习记忆损伤模型，可造成功能性改变，此模型损伤可逆[ 1 ]，但对于长期给药所造成的损伤尚不明确。段新等[3]发现，东莨菪碱2 mg/kg慢性给药条件下，对大鼠记忆有一定损害，对神经元突触可塑性有轻微影响。本研究拟连续14天给予不同剂量东莨菪碱，通过Morris水迷宫、跳台等行为学实验，考察东莨菪碱长期给药后能否造成学习记忆损伤模型。并通过BrdU+DCX双重免疫荧光染色及脑组织AChE、SOD、MDA等生化指标，研究东莨菪碱长期给药是否影响脑组织神经元增殖分化，改变酶活性，造成氧化损伤，从而影响学习记忆功能，探索持续14天给药条件下不同剂量东莨菪碱对小鼠学习记忆能力的影响及长期给药对脑组织损伤程度，探究其作用机制，为后续研究工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康ICR雄性小鼠，体重18 g，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证编号：20170005025670，许可证号码：SCXK（沪）2017-0005。小鼠饲料是标准固体飼料，自由饮水。

1.1.2 试剂

东莨菪碱氢溴酸盐（Aladdin Industrial Corporation，批号：H1507073），考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 （批号：20181221）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，AChE）测定试剂盒（批号：20191231）总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒（批号：20200806）、微量丙二醛（MDA）测试盒（批号：20200811），均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 仪器

Noldus动物轨迹识别系统，吉良软件避暗记录仪，YLS-3TB跳台记录仪，TL-2010S型组织匀浆器，Fresco21型台式高速冷冻离心机，GHP-9080型隔水式电热恒温培养箱，Thermo全波长酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立

ICR小鼠适应性饲养7天， 随机分为空白对照组、14天造模组（连续给予东莨菪碱腹腔注射14天，行为学试验期间给予生理盐水，腹腔注射30 min后进行行为学试验）和14天持续造模组（连续给予东莨菪碱腹腔注射14天，行为学试验期间给予东莨菪碱，腹腔注射30 min后进行行为学试验[4]），如图1。 14天造模组包括1 mg/kg组（以下简称14-1组）、2 mg/kg组（简称14-2组）、4 mg/kg组（简称14-4组）。14天持续造模组包括1 mg/kg组（简称14C-1组）、2 mg/kg组（简称14C-2组）、4 mg/kg组（简称14C-4组）。分为两批试验。（1）每组6只动物，14-1组、14-2组、14-4组、14C-1组、14C-2组、14C-4组分别腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，第11～14天腹腔注射BrdU 50 mg/kg。第15天开始Morris水迷宫实验，试验结束取脑进行BrdU+DCX双重免疫荧光染色实验。（2）每组10只动物，14-1组、14-2组、14-4组、14C-1组、14C-2组、14C-4组分别腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。第15天开始跳台实验，试验结束取脑制备脑组织匀浆，测定脑组织蛋白含量、AchE、SOD活性和MDA含量。

1.2.2 Morris水迷宫实验

第15天开始Morris水迷宫训练。训练方式：每次每只小鼠先放在位于第Ⅳ象限的平台上熟悉15 s，再将小鼠于第Ⅳ象限面壁投入水中，使其寻找平台，小鼠寻找到隐匿平台后捞出擦干，此时间为潜伏期。以60 s为限，如果60 s仍找不到平台，可引导其找到平台，然后在平台滞留20 s。休息10 min后，再依次将小鼠放入第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限游泳以寻找平台，其余过程同上。每天训练1次，连续5 d。记录潜伏期，该潜伏期反映动物学习记忆能力。

第6天进行撤台实验。将位于第Ⅳ象限的平台撤除，将小鼠从水池的第Ⅱ象限面向池壁放入水中，游泳寻找平台1 min。Morris水迷宫Noldus统计软件将记录每只小鼠穿越平台所在位置的次数，分别在4个象限的活动路程，以及在平台中心区域及外围区域的活动时间及路程等，并进行统计处理。

1.2.3 免疫组化染色

麻醉小鼠，经多聚甲醛心脏灌流后取脑，放入含适量多聚甲醛溶液的离心管中维持形态。制备石蜡包埋切片，BrdU+DCX免疫荧光染色，计数BrdU、DCX阳性细胞数。

1.2.4 跳台试验

YLS-3TB小鼠跳台记录仪由5室构成，每室120 mm×120 mm×180 mm，每室左上角放置一个3 cm×3 cm×3 cm绝缘跳台座，底部有铜栅按0.5 cm间距排列铺成，可以通36 V直流电。让小鼠在箱内适应5 min后通电。24 h后重复进行，测其记忆保持能力。将上述刺激过的小鼠置于绝缘平台上，随即通电并开始计时，动物受到电击后的正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。从计时开始到小鼠第一次跳下平台的时间，作为潜伏期，即小鼠的学习能力，潜伏期>300 s则按300 s记录，同时记录5 min内小鼠跳下平台遭受电击的次数（即错误次数），以此作为记忆能力的成绩。

1.2.5 取材及脑组织匀浆制备

行为学检测结束后，小鼠断头处死，取脑，用冷生理盐水为匀浆介质，置EP管，匀浆器60 Hz 30 s研磨制成脑组织匀浆4 ℃条件下将脑组织匀浆4000 rpm离心5 min，取上清液测定AchE、SOD活性及MDA含量等生化指标。

2 结果

2.1 水迷宫实验

（1）训练期间不同组别小鼠寻找平台潜伏期、目标象限停留时间、周围区域停留时间结果见表1～3和图2。 Control组随训练天数的增加，其寻找平台潜伏期逐渐缩短，小鼠在目标象限的停留时间延长。东莨菪碱给药14天后，其变化趋势与Control组相似，随训练天数的增加，其寻找平台潜伏期逐渐缩短，小鼠在目标象限的停留时间延长，但期间波动较大。

1.2.6 脑组织AChE、SOD活性和MDA含量测定

按照测定试剂盒说明书进行操作，测定脑组织AChE、SOD活性和MDA含量。

1.2.7 统计学方法

数据均以（x±s）表示，显著性分析采用One way ANOVA检验样本总体是否有差异，若有差异，则再以t检验检验各组与空白对照组之间的差异，以P<0.05或为具有统计学意义。（2）撤台测试结果见表4和图3。测试当天，给药14天后，模型小鼠找寻目标平台潜伏期较Control组有所升高，但无显著性差异（P>0.05）；1 mg/kg组和2 mg/kg组穿越平台次数接近，较Control组次数减少，无显著性差异（P>0.05），4 mg/kg组穿越平台次数显著少于Control组（P<0.05）。

2.2 免疫组化染色结果

BrdU+/DCX+双重免疫荧光染色结果显示见表5和图4、5。结果显示，14天持续造模组BrdU+细胞数与对照组相比减少，有极显著差异（P<0.01），1 mg/kg组和2 mg/kg组BrdU+细胞数接近，高于4 mg/kg组，随东莨菪碱剂量增加，BrdU+细胞数减少；DCX+细胞数随东莨菪碱剂量增加而减少，1 mg/kg组与对照组相比DCX+细胞数有所降低，但没有显著性差异（P>0.05），2 mg/kg组和4 mg/kg组与对照组相比减少，有显著差异（P<0.05）；4 mg/kg组BrdU+/ DCX+与对照组相比降低，有极显著差异（P<0.01）。14天造模组BrdU+细胞数与对照组相比减少，有极显著差异（P<0.01），1 mg/kg组和2 mg/kg组BrdU+细胞数接近，高于4 mg/kg组，随东莨菪碱剂量增加，BrdU+细胞数减少；DCX+细胞数随东莨菪碱剂量增加而减少，与空白对照组相比有所降低，但没有显著差异（P>0.05）；4 mg/kg组BrdU+/DCX+与对照组相比降低，有显著差异（P<0.05）。

随东莨菪碱剂量增加，错误次数依次增加，与空白对照组相比，没有显著差异（P>0.05）。

2.3 跳台试验

不同组别小鼠跳台试验潜伏期和错误次数见表6和图6。给药14天后，1模型小鼠跳下站台的潜伏期，随东莨菪碱剂量增加，其潜伏期依次缩短，但与空白对照组相比，没有显著性差异（P>0.05）；跳台错误次数随莨菪碱剂量增加，错误次数依次增加，与空白对照组相比，没有显著差异（P>0.05）。

2.4 小鼠脑组织蛋白含量与乙酰胆碱酯酶活性

各组脑组织匀浆中总蛋白含量无显著性差异（P>0.05）。14天持续造模组中，1 mg/kg组胆碱酯酶活性与照组相比有所上升，但没有显著性差异（P>0.05）；

2 mg/kg组和4 mg/kg组胆碱酯酶活性均值接近，显著高于对照组（P<0.05）。14天造模组中，1 mg/kg组胆碱酯酶活性与对照组相比有所上升，但没有显著性差异（P>0.05）；2 mg/kg组和4 mg/kg组胆碱酯酶活性显著高于对照组（P<0.05）。

2.5 小鼠脑组织SOD活性和MDA含量

结果显示，14天持续造模组中，1 mg/kg组和2 mg/kg组小鼠的单位蛋白SOD活性较对照组降低，但没有低于对照组（P<0.05）；1 mg/kg組和2 mg/kg组MDA含量与对照组相比增加，但没有显著差异（P>0.05），4 mg/kg组MDA含量明显高于对照组（P<0.05）。14天造模组显著差异（P>0.05），4 mg/kg组单位蛋白SOD活性明显小鼠的单位蛋白SOD活性与对照组相比降低，但没有显著差异（P>0.05），且随东莨菪碱剂量增加，其活性依次降低；MDA含量较空白对照组有所增加，但没有显著差异（P>0.05），且随东莨菪碱剂量增加，其含量依次升高。

3 讨论

Morris水迷宫试验结果表明，腹腔注射东莨菪碱可影响模型组小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间等，期间训练结果有较大波动。测试当天，14天造模组小鼠找寻平台潜伏期增加，穿越平台次数减少，与东莨菪碱剂量存在相关性，4 mg/kg组穿越平台次数与空白对照组有显著性差异，表明东莨菪碱长期给药后可一定程度影响小鼠的学习记忆能力，其影响强度与剂量有关。训练期间，14天造模组与空白对照组变化趋势相近，基本无显著性差异，14天持续造模组则有显著性差异，推测长期给与东莨菪碱后，小鼠有一定学习记忆损伤，但最终通过训练形成的记忆与正常小鼠几乎无差异，与东莨菪碱重复5天[5]和21天[3]给药造成的学习记忆行为改变相似，验证了Duka[6]文献中东莨菪碱干扰信息的获取，但不影响空间参照记忆的保持。

同时跳台实验结果显示，随剂量增加，给予东莨菪碱14天后可缩短造模小鼠跳下平台的潜伏期，增加错误次数，即东莨菪碱对模型小鼠学习记忆能力损伤有剂量关系，与高莉等[ 1 ]对东莨菪碱单次给药研究结果相符，但跳台结果未显示出显著性差异，表明这三种剂量下东莨菪给药14天后对小鼠学习和被动回避记忆能力有一定损伤作用，但不能作为理想的学习记忆损伤模型。

基底前脑复合体胆碱能神经元丢失是老年性痴呆症的病理改变特征之一，因而可影响脑内乙酰胆碱的合成、贮存、释放、灭活及与受体相互作用等。本实验通过测定脑内蛋白含量，AchE活性，发现长期给予东莨菪碱后，模型组小鼠的AChE活性升高。乙酰胆碱作为神经元中的主要的兴奋性神经递质，对于记忆的保留至关重要。本研究中AChE活性升高，推测可使乙酰胆碱降解增加，降低乙酰胆碱含量，影响小鼠记忆功能，且东莨菪碱2 mg/kg、4 mg/kg组活性相似，均高于1 mg/kg组，进一步证实东莨菪碱对小鼠记忆损伤存在剂量-效应关系。

研究发现，在老年痴呆症患者脑内大量神经元持续性受损，主要发生在海马CA1 区。同时神经元损伤与海马神经再生不足加速了AD病程的发展[7-8]。BrdU标记新生神经元有丝分裂过程，DCX标记未成熟神经元，因此BrdU+/DCX+双标能够特异性显示新生神经元的增殖过程[9-10]。结果显示，长期给予东莨菪碱后，BrdU+细胞数显著降低，对阻碍神经细胞增殖作用显著，同时BrdU+/DCX+有所降低，尤其4 mg/kg组BrdU+/DCX+显著降低，表明长期给予东莨菪碱可能阻碍神经再生过程，且有剂量-效应关系。

众多对于东莨菪碱造模的AD药物研究文献中均考察了药物对SOD和MDA的影响[ 1 1 ]。SOD是抗氧化酶，可清除脑内过量氧自由基，MDA是脂质过氧化降解产物，其含量与细胞损伤呈正相关。单次给与东莨菪碱，可使SOD活性降低，MDA含量增加。本研究发现，东莨菪碱长期给药对SOD和 MDA影响较小，但仍存在SOD活性降低和MDA含量增加趋势，且呈剂量关系。4 mg/kg持续造模可显著降低SOD活性，增加MDA含量，影响脂质过氧化，造成神经细胞损伤，从而引起记忆障碍。

4 结论

东莨菪碱长期给药后可造成小鼠学习记忆行为损伤和神经细胞损伤，其作用机制可能与神经细胞再生障碍和氧化损伤有关。

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