菌藻复合生物膜污水反应器中真菌群落结构分析

李 明, 王 洋, 贾 翔, 吴 磊, 王 超, 高兴爱, 李忠和*

(1.吉林建筑大学市政与环境工程学院, 松辽流域水环境教育部重点实验室，长春 130118；2.辽宁省环保集团有限责任公司，沈阳 110000；3.吉林省农业科学院，长春 130124)

近年来，微藻和微生物在污水处理领域研究的深入，菌藻复合生物膜在水处理方面的研究在中外得到了普遍关注[1]。与传统污水处理技术相比，菌藻复合生物膜污水处理技术具有脱氮除磷效果显著等优点，是备受关注的新型绿色能源技术[2-3]。

菌藻之间互利共生、共栖是菌藻生物膜微生态群落持续稳定的基础。藻类光合作用产生的氧气比曝气产氧可以被菌体有效利用，这样细菌对污染物质的去除显著提高，且能耗降低、节约成本。同时，微藻在新陈代谢过程中通常会释放生物大分子，如氨基酸、蛋白质、多糖、脂类和碳水化合物等。细菌新陈代谢呼出的二氧化碳气体还会被藻类所利用，从而形成了一种互利共生的关系，从而提高藻类对营养物质(氮磷等)的去除[4]。此外，细菌会释放维生素、酶等促进藻类生长。所以，利用菌藻之间的互利共生原理，通过菌、藻微生物构建复合系统将菌藻各自的功能有机整合，从而提升对污水中氮磷营养物和有机物污染物降解能力，这为开发低碳、高效的生活污水处理技术提供了新的思路[5]。

随着分子生物学、代谢组学和转录学等技术的发展，菌藻关系的研究逐渐深入。然而，菌藻复合生物膜中的真菌也是其可不忽视的组成部分，但是相关的报道却十分有限[6]。因此，本研究拟采用高通量测序技术，分析菌藻复合生物膜反应器中的真菌群落结构，这对进一步研究菌藻生物膜的形成和演替机理以及污染物的去除机制具有一定的指导意义，同时为提升菌藻生物膜污水处理技术提供理论依据。

1 实验过程

1.1 菌藻生物膜样本采集

在菌藻复合生物膜反应器中，使用无菌聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)管随机采集生物膜样本3份，合并混匀为一份，存放至-80 ℃的冰箱中，待提取检测分析[7]。

1.2 DNA的提取与质量评估

使用DNA SPIN extraction kits(MP Bio, USA)试剂盒提取DNA。使用紫外可见分光光度计(Quawell Q5000, USA)检测DNA浓度，利用D260/D280值检测DNA的纯度；并通过脂糖凝胶电泳和成像检测DNA的完整性[8]。

1.3 真菌DNA扩增测序

使用菌藻复合生物膜中提取的DNA原液作为真菌的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增模板，使用ITS5(GGA AGTAAAAGTCGTA ACAAGG)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)引物为对真菌ITS1区进行PCR扩增。扩增30个循环，参数为:预变性(98 ℃，2 min)，变性(98 ℃，15 s)，退火(55 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，5 min)。反应结束后，PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用对菌藻生物膜样本中的真菌进行测序(Illumina MiSeq)。

1.4 测序数据处理与分析

为了整合原始双端测序数据，①通过滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列进行质量筛查(从5’端第一个碱基位置开始移动，窗口为10 bp，步长为1 bp，且要求≥ 99%的碱基平均测序准确率)；②使用FLASH软件，配对连接质量初筛过的双碱基，两条碱基序列Read 1与Read 2的重叠长度应≥10 bp，并根据样本所对应的Index信息分配入对应样本；③使用QIIME软件，对所获得的相似序列为97%的碱基序列进行归并和可操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)划分，对于低于总测序总量0.001%丰度值的OUT剔除。

使用Origin软件绘制碱基序列长度分布图、以及每个测序深度下的OTU稀疏曲线、OUT分类鉴定图，以及生物膜中真菌的类水平特征、物种丰度和多样性分布图。

2 结果与分析

2.1 测序筛选与OUT划分

研究以菌藻生物膜中的真菌为研究对象，通过原始真菌的测序序列进行拼接过滤，去除嵌合体和非靶区域序列，经质量筛查、有效序列Index匹配，最终获得真菌有效序列为44 323条。如图1所示，菌藻生物膜样本中真菌的序列长度覆盖了150～400区间，主要集中在150～330之间，特别是200～270之间。

图1 序列长度分布

对样品中真菌序列丰度低于菌藻生物膜样本中测序总量0.001%的真菌OUT进行剔除，之后再对真菌在门、纲、目、科、属、种的OTU划分(图2)得出，样本中的真菌125门、115纲、111目、92科、76属、139种，未分类(指未能归属到任何已知分类单元的OTU数)23。

图2 OTU划分和分类地位鉴定

2.2 多样性分析

OTU丰富等级曲线用于分析物种的多样性物种丰度以及物种的均匀度这两个特征[9]。如图3所示，在水平方向上，OTU丰富等级曲线的宽度代表真菌物种的丰度情况，从110～160水平方向上范围最大，说明这区间样品中真菌物种的丰度越高；在OTU丰富等级曲线垂直方向上的平缓程度体现了样本中真菌物种的均匀度，从60水平之后曲线趋于平缓，这说明物种分布逐渐均匀。

图3 OTU丰度等级曲线

将真菌序列数与其对应观察的物种数和香农指数关系，如图4所示。在序列数<2 000时，随着样本测序量的增加，香农指数急剧增加；序列数>2 000 时，随着样本测序量的增加，香农指数已经平衡。香浓指数是评价群落多样性的重要指标之一，数值与群落的多样性正相关，菌藻生物膜中真的香浓指数为2.59。当序列数<20 000时，观察到的物种数量随着样本测序量的加而增加，新的真菌不断出现；当测序条带数量>20 000时，观察到的物种数量增加较少，稀疏曲线趋于饱和新的真菌不再增加，这说明本研究无需加大样本测序的深度，可以涵盖到菌藻生物膜样品中的整个真菌菌群，已经反映菌藻生物膜中真菌群落组成。

图4 真菌稀疏曲线

2.3 分类学组成分析

根据菌藻生物膜中真菌分类地位鉴定结果，如图5所示，从而获得菌藻生物膜中真菌在门、纲、目、科、属、种组成的不同分类水平的具体组成。研究中菌藻复合生物膜样品中真菌OUT分类属于8个门、16个纲、31个目、34个科、41个属和76个种。

图5 真菌分类鉴定

进一步对OUT分类序列利用QIIME软件对与数据库的模板序列相比对，从而获取每个OTU对应的真菌分类学信息，对于相对丰度小于0.01%和未鉴定的OUT统称为未分类。

研究在菌藻生物膜样品中鉴定到真菌门类为4个，如图6所示。相对丰度比例最大为球囊菌门(Glomeromycota)为40.00%，其为菌藻生物膜中真菌的优势门。球囊菌门为真菌的主要门类之一，在土壤环境和水环境中普遍存在[10-11]。子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)相对丰度比例比较接近为次优势门类，相对丰度比例分别约24.90%和24.80%。壶菌多处于水生环境中[10]，特别是寄生于藻类、原生动物以及其他真菌上，具有促进坏死部分分解的作用，而研究壶菌门(Chytri-diomycota)相对丰度比例比最低，为3.10%，这很可能因为菌藻生物膜中的群落状态良好，从而导致其缺乏生长与附着条件。

图6 真菌门水平相对丰度

为了进一步深入分析菌藻生物膜中真菌组成特征，对样本进行属水平真菌群落分类鉴定，如表1所示，其中未确定属和丰度小于0.01%的属水平真菌定义为未鉴定(unidentified)。球囊菌门(Ascomycota)在属水平数量最多，有6个属，其中:盘菌属Peziza相对丰度最大为23.5%，而黑酵母菌属(Aureobasidium)0.2%，曲霉菌属(Aspergillus)、苏吉雅玛酸乳杆菌属(Capnobotryella)、嗜热真菌属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)不足1%，unidentified为0.6%。担子菌门(Basidiomycota)在属水平上次之，有4个属。其中:未命名属(Paratritirachium)为2.30%，布勒弹孢酵母属(Bullera)为0.40%，未命名属(Colacogloea)为0.40%，亡革菌属(Thanatephorus)为0.30%，未确定属(unidentified)为21.40%。球囊菌门(Glomeromycota)在属水平上只有两个属，其中雷德克拉属(Redeckera)相对丰度最高，达39.80%，但无梗囊霉属(Acaulospora)相对丰度较低，仅为0.20%。

表1 真菌属水平相对丰度

3 结论

菌藻复合生物膜污水处理反应器中真菌的序列长度覆盖了150～400区间，主要集中在150～330之间，特别是200～270之间。菌藻复合生物膜样品中真菌OUT分类属于4个门和12个属。在门水平上，真菌优势门球囊菌门为(Ascomycota)丰度约为40.00%，次优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)相对丰度为24.90%和24.80%。在属水平上，真菌优势属雷德克拉属(Redeckera)丰度最高为39.80%，次优势属为泡质盘菌(Peziza)23.50%。研究结果对进一步深入研究菌藻生物膜污水反应器中真菌群落功能和污水机制具有重要的理论和指导意义。