橄榄苦苷对人前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响*

田 凤，龙梦晖，宁志丰，佘同辉**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院基础医学院)

前列腺癌(prostatic cancer，PCa)是一种常见实体肿瘤，也是男性癌症相关发病率的主要原因[1]。目前，晚期前列腺癌仍然是最常见和致命的癌症之一，严重威胁着我国人民的生命健康。橄榄苦苷(oleuropein)是一种存在于橄榄科植物中的天然酚类化合物，无论单独还是联合使用，它在恶性肿瘤中均显示出重要的抗癌潜力[2]。因此，本研究以人前列腺癌细胞株PC-3为研究对象，通过体外细胞实验来探讨不同浓度的橄榄苦苷对人前列腺癌的抑制作用，以期为橄榄苦苷在临床上的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

橄榄苦苷购自SIGMA公司，先用DMSO配成10mmol/L的橄榄苦苷原液，然后按实验要求用RPMI-1640培养基稀释成0、20、40、80、160、320μmol/L；Bad、Bcl-2购自中国碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人前列腺癌细胞株PC-3购自中国典藏物培养中心，液氮保存。将PC-3细胞培养在含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，取对数生长期细胞状态良好的细胞进行实验，所有实验重复6次。

1.2.2 细胞增殖

采用MTT实验。调整培养的PC-3细胞密度为1.0×106/mL，以5000个/孔细胞接种于96孔板，于给药后24h加MTT溶液，并用酶标仪于490 nm处测出每孔的吸光度(A)值。

1.2.3 细胞迁移

采用划痕实验。取对数生长期的PC-3细胞，以1.0×105个/孔接种于6孔板，过夜培养后划痕，PBS润洗，加入2mL含药物的无血清培养基，于培养0、24h后拍取相应时间点的照片。

1.2.4 细胞侵袭

采用Transwell实验。上室铺Matrigel胶待其凝固后，PC-3细胞以1.0×105个/孔接种于上室，下室加含药物的培养液，培养24h后，用棉签轻轻擦去未穿膜的细胞，0.1%结晶紫染色后，显微镜下拍照并计数。

1.2.5 蛋白检测

采用Western blot实验检测。取经不同浓度橄榄苦苷处理24h的PC-3细胞，经细胞收集、蛋白提取、上样，电泳、转膜、抗体孵育后，于成像系统中曝光，以β-action为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 橄榄苦苷对PC-3细胞增殖的影响

MTT实验结果显示(图1)，给药24h后，与空白对照组相比，橄榄苦苷处理组(20、40、80、160、320μmol/L)细胞活力均受到不同程度的抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，且随橄榄苦苷药物浓度的增加而降低。

与空白对照组比较，*P<0.05(n=6)

2.2 橄榄苦苷对PC-3细胞迁移能力的影响

划痕实验结果如图2(封二)，数据分析显示：在橄榄苦苷作用24h后，空白对照组的细胞迁移抑制率为(78.17±7.81)%；与空白对照组相比，20、80、320μmol/L橄榄苦苷处理组的划痕宽度明显增加，其迁移抑制率明显降低(P<0.05)，分别为(64.52±4.23)%、(51.28±3.26)%及(30.81±2.01)%，且呈浓度依赖性。

2.3 橄榄苦苷对PC-3细胞侵袭的影响

Transwell侵袭实验结果如图3(封二)，数据统计显示：橄榄苦苷作用于PC-3细胞24h后，空白对照组单视野下侵袭细胞数目为(269.00±21.21)；与空白对照组相比，20、80、320μmol/L橄榄苦苷处理组单视野下侵袭细胞数目明显减少(P<0.05)，分别为(214.00±19.56)、(134.00±13.32)及(69.00±11.23)，且呈浓度依赖性。

2.4 橄榄苦苷对PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot结果及统计分析显示：与空白对照组比较，20、80、320μmol/L橄榄苦苷处理组PC-3细胞中Bcl-2表达呈下调趋势，且有统计差异(P<0.05)；Bad的表达与橄榄苦苷浓度相关并呈上调趋势，且320μM橄榄苦苷处理组与空白对照组有显著差异(P<0.05)。

与空白组比较，*P<0.05(n=6)

3 讨 论

前列腺癌是现阶段困扰中老年男性健康的常见疾病之一，每年因患前列腺癌而死亡的人数多达25万人[3]。目前，针对前列腺癌的治疗方法包括雄激素受体阻断疗法、前列腺根治切除术及放射治疗等，由于前列腺癌发病隐匿、潜伏期长，以及居民健康意识的匮乏，大多数癌症患者在疾病进程的晚期才被诊断出来，并且这些晚期癌症患者并不适合手术切除治疗；同时，放疗和化疗对这些晚期癌症患者的疗效也非常有限[4]。因此，寻求一种疗效佳、毒副作用小的抗癌药物显得尤为重要。

橄榄苦苷是一种源于天然橄榄油或橄榄叶中的酚类化合物，是油橄榄叶中起活性作用的主要成分[5]。研究发现，橄榄苦苷对肝癌、神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤均有抗癌作用[6-7]。目前，橄榄苦苷在前列腺癌中的研究报道较少。Aktas等[8]研究发现，橄榄苦苷可通过阻断电压门控钠通道来抑制前列腺癌细胞运动和转移，进而抑制前列腺癌的生长。本研究观察了不同浓度的橄榄苦苷作用于PC-3细胞后细胞活力的影响，发现细胞活力随着橄榄苦苷药物浓度的升高而降低；同时显示，PC-3细胞经橄榄苦苷处理后，划痕闭合率显著降低，侵袭细胞数目明显减少。

Bcl-2是一种凋亡抑制因子，而Bad是凋亡蛋白，Bad可与Bcl-2结合形成异源二聚体，共同参与肿瘤细胞的凋亡过程，因此，诱导Bad蛋白表达及抑制Bcl-2蛋白表达均能够有效促进癌细胞凋亡[9]。本研究发现，橄榄苦苷作用于PC-3细胞后，细胞中Bcl-2蛋白表达有下降趋势、Bad蛋白表达有上升趋势；因此，推测橄榄苦苷可能通过调节上述凋亡相关蛋白的表达来促进PC-3细胞凋亡。

综上所述，橄榄苦苷可抑制PC-3细胞的生长、迁移及侵袭，且通过与“线粒体通路”中Bcl-2蛋白表达降低以及Bad蛋白表达升高来诱导PC-3细胞凋亡，从而为橄榄苦苷作为潜在的抗前列腺癌药物提供了一定的实验依据。