辣椒炭疽病菌效应因子NIS1-PCR-RFLP标记系统的建立

欧阳超，刘思珍，满益龙，盛家伟，陈岳，张鑫，刘勇，张德咏，谭新球

摘要：【目的】基于辣椒炭疽病菌種群复杂、田间复合侵染种群组成不清，导致防控相对困难的问题，建立一种快速直观的辣椒炭疽病菌区分标记系统，为其病害田间防控提供科学依据。【方法】利用rDNA-ITS通用引物克隆田间分离的22株辣椒炭疽病菌rDNA-ITS，通过其序列比对分析构建系统发育进化树，初步确定22株供试菌株的种类和分类地位;选用效应因子NIS1基因为靶标，根据辣椒胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和黄瓜炭疽菌（C. orbiculare）NIS1基因比对分析，设计NIS1基因简并引物，克隆22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因，利用其序列比对分析构建系统发育进化树，分析比较rDNA-ITS和NIS1基因区分供试菌株的差异，进而对22株不同辣椒炭疽病菌NIS1基因进行分析，选择限制性内切酶，分析NIS1基因的PCR产物限制性片段多态性（RFLP）差异，建立NIS1-PCR-RFLP标记系统。【结果】rDNA-ITS序列系统进化分析表明22株辣椒炭疽病菌属于5种炭疽病菌，即胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、短孢炭疽菌（C. brevisporum）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平头炭疽菌（C. truncatum）和黑点炭疽菌（C. capsici），其序列同源性为85.6%～99.8%，但C. capsici和C. truncatum处于同一混合组群;22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因两端序列较保守，中间存在可变区，与已报道的C. orbiculare的NIS1基因同源性在34.6%～78.9%;NIS1基因系统发育进化树能将22株辣椒炭疽病菌分成5个组群，C. capsici和C. truncatum处于不同组群，表明其区分度优于rDNA-ITS;NIS1-PCR- RFLP主要差异片段显示C. gloeosporioides和C. brevisporum的最大片段均为210 bp，但片段数目不同，而C. acutatum为292 bp，C. capsici为685 bp，C. truncatum为345 bp，参照菌株C. orbiculare为497 bp，能够直观观察区分。【结论】研究建立的NIS1-PCR-RFLP标记系统可简便、直观地区分不同辣椒炭疽病菌的差异，有望发展成为真菌新的分子标记应用于田间辣椒炭疽病菌种群的快速鉴定。

关键词： 辣椒炭疽病菌;效应因子NIS1;PCR-RFLP;标记系统;核糖体DNA转录间隔区（rDNA-ITS）

中图分类号： S436.418.11                     文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）09-2473-09

Development of NIS1-PCR-RFLP marker system to effectors of Colletotrichum spp. from infected pepper plants

OUYANG Chao1，2， LIU Si-zhen1，2， MAN Yi-long3， SHENG Jia-wei2，4， CHEN Yue2，

ZHANG Xin2， LIU Yong1，2， ZHANG De-yong1，2， TAN Xin-qiu1，2*

（1Long Ping Branch，Graduate School of Hunan University， Changsha  410125， China; 2Plant Protection Institute，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha  410125， China; 3Biotechnology Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha  410125， China; 4Agricultural University of Hunan， Changsha  410000， China）

Abstract：【Objective】Based on the complex population of pepper anthracnose and unclear composition of compound infection population in the fields， it was relatively difficult to control capsicum anthracis. Therefore， a rapid and intuitive marking system for pepper anthracnose was established to provide scientific basis for field control of the disease. 【Me-thod】The rDNA-ITS primers were used to clone 22 isolates of pepper Colletotrichum spp. isolated from field. The phylogenetic tree was constructed by sequence alignment analysis， and the species and taxonomic status of 22 isolates were preliminarily determined. An effector NIS1 gene as target， its alignment was performed between Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum orbiculare to design degenerate primers of NIS1 by genome database. NIS1 gene was isolated and cloned of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， and phylogenetic tree of NIS1 gene was constructed with their NIS1 sequences alignment. Analyzed and compared the genes of rDNA-ITS and NIS1 gene to distinguish the diffe-rence of the tested strains， and then analyzed the NIS1 gene of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， selected restriction endonuclease， analyzed the difference of PCR product restriction fragment length polymorphism （RFLP） of NIS1 gene， and established the NIS1-PCR-RFLP labeling system. 【Result】Phylogenetic analysis of rDNA-ITS sequences showed that 22 strains of Colletotrichum spp. belonged to 5 species of C. gloeosporioides， C. brevisporum， C. acutatum， C. truncatum and C. capsici， and their sequences homology was 85.6%-99.8%， but C. capsici and C. truncatum were in the same mixed group. The NIS1 gene sequences of 22 strains of Colletotrichum spp. were conserved， and there was varia-ble region in the middle， which was 34.6%-78.9% homologous with the NIS1 gene of C. orbiculare. The NIS1 gene phylogenetic tree could divide 22 strains of Colletotrichum spp. into 5 groups， and C. capsici and C. truncatum were in diffe-rent groups， indicating that their differentiation was better than rDNA-ITS. NIS1-PCR-RFLP showed that the maximum fragments of C. gloeosporioides and C. brevisporum were both 210 bp， but the number of fragments was different， while those of C. acutatum， C. capsici and C. truncatum were 292， 685， and 345 bp， respectively. The reference strain C. orbiculare was 497 bp， which can be visually distinguished. 【Conclusion】The NIS1-PCR-RFLP marking system was established in this study， it can easily and directly distinguish the differences of different Colletotrichum spp. infected pepper plants， Therefore， the NIS1-PCR-RFLP marking system is expected to be developed into a new fungal molecular marker for rapid identification of Colletotrichum spp. from infected pepper plants in field.

Key words： pepper Colletotrichum spp.; effector NIS1; PCR-RFLP;marker system; rDNA internal transcribed spacers （rDNA-ITS）

Foundation item： General Project of National Natural Science Foundation of China（31972223）; Youth Fund of National Natural Science of China（31701814）; Hunan Agriculture Science and Technology Innovation Fund Project（2020CX39， 2020CX43）

0 引言

【研究意义】辣椒炭疽病是辣椒生产过程中的重要真菌病害之一，其种类多、寄主范围广、危害重，且传播速度快（Mongkolpn and Taylo，2018;Toporek and Keinath，2020;Naveen et al.，2021）。目前我国已报道的辣椒炭疽病菌种群主要包括胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平頭炭疽菌（C. truncatum）、黑点炭疽菌（C. capsici）和短孢炭疽菌（C. brevisporum）5种，严重威胁辣椒生产（Diao et al.，2017;魏立娟，2019）。田间采样检测证实辣椒炭疽病菌主要以复合侵染为主，复合侵染率高达30%～50%，这可能是田间防治困难的重要原因之一（Ren et al.，2020）。不同辣椒炭疽病菌对化学药剂的敏感性存在巨大差异，满益龙等（2016）研究发现不同炭疽病菌对化学农药唑菌酯的敏感性最高相差300倍，推测是田间化学防控效率低的重要原因。辣椒炭疽病菌遗传复杂多样，曾泉（2019）研究表明不同来源的胶孢炭疽菌种群内存在明显的遗传多样性，且不同地区的优势种群内存在明显遗传差异;此外，菌株本身的形态学特征和致病性等也存在类似现象;霍建飞等（2020a）、周建波等（2020）研究也证实辣椒炭疽病菌遗传变异与地理结构和寄主植物存在一定的相关性。因此，寻求一种快速、有效区分不同种类炭疽病菌的方法，是实现田间早期辣椒炭疽病精准防治的重要基础。【前人研究进展】植物病原真菌的分子标记多样，研究人员根据研究对象和基因组数据，采用不同分子标记使相同的供试菌株遗传多样性展现得更清楚。真菌不同分子标记系统具有自身的特点，但目前为止尚无完全统一的模式，基本上根据研究需要在现有基础上发展或综合不同的标记体系。相比较而言，国内外构建的炭疽菌（Colletotrichum spp.）系统鉴定常用的分子标记系统中，rDNA-ITS因具有序列片段小、高拷贝数等特点在炭疽菌的鉴定和系统发育研究中占据重要位置，如利用rDNA-ITS对紫山药炭疽病菌（韩晓勇等，2020）、辣椒炭疽病菌（霍建飞等，2020b）、山竹炭疽病菌（杨冬平等，2020）、油茶炭疽病菌（尹华庆等，2020）和大豆炭疽病菌（毕秋艳等，2021）等进行鉴定和分类研究，但研究表明利用rDNA-ITS序列不能有效区分近缘种，如C. capsici和C. truncatum（曾大兴，2004;满益龙等，2016）。为此，研究人员开发了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）、交配型基因（MAT1-2-1）、肌动蛋白基因（ACT）、DNA裂解酶基因（APN2）、GAPDH与假设蛋白基因间间隔区（GAP 2-IGS）、钙调素基因（CAL）、几丁质合成酶A基因（CHS-1）、谷氨酰胺合成酶基因（GS）、组蛋白基因（HIS3）、超氧化物歧化酶基因SOD2和β-微管蛋白基因TUB2（韩长志，2015;Villafana et al.，2019）等多基因复合标记系统，如刘威等（2017）采用形态学结合基于GS、TUB2和rDNA-ITS等基因序列联合分析茶树炭疽病原菌;Diao等（2017）利用ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2和HIS3多基因序列联合分析全国29个省（区、直辖市）的典型辣椒炭疽病菌;王妮等（2019）采用ITS、ACT、TUB2、CHS1和GAPDH多基因序列联合分析辣椒炭疽病病原菌;王雪菲等（2020）采用CAL和GS多基因序列分析核桃炭疽病病原菌。虽然多基因联合分析可为一些炭疽病菌复合种群的分类鉴定提供最佳标记，但在实际应用中，其程序复杂、耗时长等缺点导致无法广泛应用，且目前没有能对所有炭疽菌种进行有效区分的标记。Willie等（2020）利用系统发育信息分析、系谱分类指数（GSI）和贝叶斯一致性分析（BCA）结合评估了13种分子标记技术在炭疽菌属系统发育中的应用，发现GAPDH、HIS3和TUB2联合区分炭疽病菌种类具有较明显的优势，但该组合对C. gloeosporioides等种群内遗传多样性区分不具备明显优势，继而发展了DNA裂解酶基因与交配型基因间间隔区（APN2/MAT-IGS）标记系统。遗憾的是，目前尚未能构建出针对性强、简单直观的分类标记系统应用于辣椒炭疽病菌种类区分。Yoshino等（2012）研究发现诱导坏死分泌蛋白基因（Necrosis-inducing secreted protein 1，NIS1）作为一个相对保守的效应因子，在黄瓜炭疽病菌（C. orbiculare）中以单拷贝的形式存在，其编码的蛋白可诱导本氏烟烟草细胞死亡。UniProt KB数据库比对分析发现CoNIS1有219个假定的同源物，广泛存在于子囊菌门和担子菌门真菌中，表明NIS1效应因子广泛存在且相对保守（Hiroki et al.，2019），特别是基因两侧相对保守，存在相对>100 bp的可变区，符合作为分子标记的基本特征。而且本课题组实验室分析辣椒C. gloeosporioides-CSLL11基因组发现NIS1基因也是以单拷贝的形式存在，基因片段大小为500 bp左右，由1个内含子和2个外显子组成;将不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因进行比对，发现不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明也可能存在生物学功能分化，这可能是病菌在环境中与寄主协同进化的结果，与Hiroki等（2019）的研究结果一致，因此，推测NIS1基因可作为一种有效区分侵染辣椒的主要炭疽菌种类新的分子标记。【本研究切入点】前人对辣椒炭疽病主要病原菌的分离鉴定和系统发育分析多采用rDNA-ITS及多基因联合分析法，而且不同研究使用不同的分子标记系统，其遗传多样性存在一定差异。真菌功能基因一直是研究热点，特别是真菌与寄主协同进化过程中，致病功能基因协同进化是真菌适应寄主植物的重要手段，而目前关于利用重要功能基因作为真菌种类鉴定的分子标记研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过克隆供试菌株的NIS1和rDNA-ITS，根据相关序列构建NIS1和rDNA-ITS系统发育进化树，确定NIS1基因在不同种辣椒炭疽病菌系统发育进化中的区分度;比对分析不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列，结合PCR-RFLP分析，明确不同辣椒炭疽病菌NIS1基因的多态性差异，实现简单、直观、快速有效区分不同种辣椒炭疽病菌，为田间辣椒炭疽病菌种群的快速鉴定和高效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌株 供试菌株主要分离自湖南辣椒主产区具有典型炭疽病病症的辣椒样品。所有分离菌株结合各形态特征和分子标记rDNA-ITS序列比对分析，初步证实为胶孢炭疽菌、尖孢炭疽菌、短孢炭疽菌、黑点炭疽菌和平头炭疽菌。另外选取1株黄瓜炭疽病菌（C. orbiculare）作为参照菌。所有供试菌株均已接种斜面4 ℃保存，具体信息见表1。

1. 1. 2 供试培养基 PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖培养基（索莱宝Solarbio公司）46 g，H2O 1 L。 PDA液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，H2O 1 L，调pH 7.2;LB固体培养基：在液体培养基的基础上每升加入15 g琼脂。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 不同辣椒炭疽病菌菌株基因组DNA提取与纯化 将斜面保存的菌株接种至PDA固体培养基中活化，28 ℃培养箱培养3 d，取直径为0.5 cm大小的菌丝饼3～4块于PDA液体培养基中28 ℃摇床培养3 d，双层纱布过滤，无菌水漂洗2次，用滤纸吸除多余水分，液氮充分研磨，采用CTAB法提取其基因组DNA，并溶于适量的无菌ddH2O中，-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 辣椒炭疽病菌rDNA-ITS片段与NIS1基因引物设计 rDNA-ITS序列引物采用通用引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和ITS5：5'-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。根据已报道的C. orbiculare NIS1（AB669517.1）基因，利用NCBI数据库进行比对分析，发现NIS1氨基酸序列相对保守，但DNA序列存在一定变异。结合辣椒胶孢炭疽菌的NIS1序列DNAMAN 5.0分析，依据C. orbiculare、C. acutatum和C. gloeosporioides NIS1上下游序列分析，根据两端保守特性设计其特异性简并引物，NIS1-F：5'-ATGCAGTTCCG（T）CG（A）CT（C）TCC A（C）T-3'，NIS1-R：5'-ACTGGCTGCC（G）GACGT AGT（G）TC（G）-3'。

1. 2. 3 ITS片段和NIS1基因的克隆 利用1.2.1的DNA為模板，1.2.2特异性引物进行梯度PCR（52～65 ℃，设置12个梯度）以确定最佳反应条件。PCR反应体系25.00 μL：包括10×Taq Buffer（含Mg2+） 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，TaKaRa Taq DNA polymerase 0.25 μL，DNA模板1.00 μL（≤200 μg），ddH2O 18.75 μL;扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火（rDNA-ITS 56 ℃，NIS1 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，共进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳反应条件。利用优化的反应条件，采用TaKaRa DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物。回收的目的DNA片段连接T1载体25 ℃ 10 min，转化DH5α感受态细胞，利用菌落PCR筛选转化子，获得的阳性转化子送生工生物工程（武汉）股份有限公司测序。

1. 2. 4 基于NISI基因和rDNA-ITS片段系统的发育进化树构建 根据生工生物工程（武汉）股份有限公司所测序列结果，将测序结果导入NCBI进行BLAST分析。用MEGA 7.0对供试辣椒炭疽病菌的NIS1基因和rDNA-ITS片段序列进行比对分析，校正后采用bootstrap test（1000次重复）构建系统发育进化树，遗传距离用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）进行计算。

1. 2. 5 NIS1基因的RFLP分析 根据NIS1基因测序结果，利用DNAMAN 5.0对目标基因NIS1进行限制性内切酶位点分析，筛选限制性内切酶。构建酶切体系20 μL：包括6 μL PCR纯化产物，1 μL Eco31I限制性内切酶（NEB），1 μL SacI限制性内切酶（NEB），2 μL Cutsmart Buffer，10 μL无菌ddH2O;反应条件：37 ℃孵育1 h，电泳后拍照观察结果。

2 结果与分析

2. 1 不同辣椒炭疽病菌的rDNA-ITS序列比对分析结果

根据供试炭疽病菌的rDNA-ITS序列聚类分析结果（图1），发现22株辣椒炭疽病菌可分为C. gloeosporioides（12株）、C. brevisporum（1株）、C. acutatum（4株）、C. truncatum和C. capsici混合（5株）4个组群。不同组群内部的同源性高达99.0%，未呈现明显的地理分布特性;不同组群间，除了C. truncatum和C. capsici混合群外，相同种群基本聚集在同一分支，其中以C. truncatum rDNA-ITS序列为参考，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum和C. capsici与其同源性分别为92.0%、85.6%、89.4%和99.8%。表明rDNA-ITS不能将C. capsici与C. truncatum有效区分。

2. 2 不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列比对分析结果

以C. orbiculare（TJ01;GenBank NO.：AB6695 17.1）为外群，构建22株供试辣椒炭疽病菌的NIS1基因系统发育进化树。结果（图2）显示，22株辣椒炭疽病菌可分为5个组群，C. capsici和C. truncatum处于不同进化分支上，但未观察到相同种群内呈现明显的地理区域差异。其中C. gloeosporioides组群包含12株菌株;C. brevisporum组群包含1株菌株;C. acutatum组群包含4株菌株;C. truncatum组群包含3株菌株;C. capsici组群包含2株菌株。表明NIS1基因可作为辣椒炭疽病菌种群遗传多样性研究的重要分子标记。此外，供试菌株NIS1基因序列比对发现，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum、C. capsici和C. truncatum与参考菌株C. orbiculare的NIS1基因同源性分别为78.5%、78.9%、70.7%、43.7%和34.6%，且其两端序列较保守，中间存在可变区。

2. 3 rDNA-ITS与NIS1基因序列对不同辣椒炭疽病菌的区分度比较结果

基于供试菌株rDNA-ITS与NIS1基因序列比较分析，相同种群内部序列的同源性较高。为此从供试菌株中选择5种辣椒炭疽病菌为代表进行区分度比较，NIS1基因将5种炭疽病菌分在不同分支，而且C. capsici和C. truncatum能清楚区分（图3-A）;而C. capsici和C. truncatum的rDNA-ITS系统发育进化处于同一分支，无法有效区分（图3-B）。表明NIS1基因对不同辣椒炭疽病菌的区分度优于rDNA-ITS。

2. 4 不同辣椒炭疽病菌NIS1-PCR-RFLP分析结果

以C. orbiculare为参照菌株，对22株供试辣椒炭疽病菌NIS1基因序列分析发现限制性内切酶Eco31I和SacI为RFLP分析的理想位点，Eco31I和SacI处理NIS1 PCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶电泳明显观察到可分离出的最大片段C. gloeosporioides为210 bp，C. acutatum为292 bp，C. capsici为685 bp，C. brevisporum为210 bp，C. truncatum为345 bp，参照菌株C. orbiculare为497 bp。尽管C. gloeosporioide和C. brevisporum可分离的最大片段相同，但RFLP的片段数目分别为5个和6个小片段，较容易区分（图4）。

3 讨论

本研究发现NIS1基因能将5种辣椒炭疽病菌清楚区分，特别是C. truncatum与C. capsici处在不同分支，但rDNA-ITS不能将其区分，表明NIS1基因的区分度高于传统单基因标记如GAPDH、GS、HIS3和TUB2标记（Ariana and Sephra，2012;肖军，2020）;值得一提的是，NIS1基因对复合种群区分结果与Willie等（2020）发展的DNA裂解酶基因与交配型基因间间隔区（APN2/MAT-IGS）标记一致。NIS1基因作为真菌侵染过程中负责靶向植物寄主免疫激酶的功能基因，Hiroki等（2019）通過NISI基因序列比对发现不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明存在生物学功能分化，推测是病菌在环境中与寄主协同进化的结果。根据UniProt KB数据库比对分析结果，NIS1基因在真菌中广泛存在而且相对保守，表明NIS1基因可作为真菌种类分子标记的新靶标，其可变区反映了不同炭疽病菌与寄主植物协同进化的差异，本研究结果与Hiroki等（2019）的研究结果一致。

基于目前辣椒种植方式（设施栽培和露地栽培）交替，田间辣椒炭疽病发病越来越严重，而且国际上不断有新的辣椒炭疽病菌报道（de Silva et al.，2019;Sheu et al.，2020;May et al.，2021），导致田间复合侵染变得更复杂。本研究中，对不同区域来源的相同种炭疽病菌进行NIS1基因序列比对分析，发现NISI基因高度保守，未体现出不同地理来源的遗传多样性差异，但对于不同炭疽病菌，区分度明显优于rDNA-ITS，是否能作为广泛的炭疽病菌种群间的分子标记，有待扩大样本量进一步验证。

曾大兴等（2004）对C. truncatum和C. capsici的rDNA-ITS序列进行RFLP序列分析，结果显示其酶切图谱完全一致，支持两者为同一菌种。Ariana和Sephr（2012）利用分子标记基因对来自木瓜和辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum进行ITS-PCR-RFLP分析，利用11种限制性内切酶对48株菌株能有效区分;其中AluI，HaeIII，PvuII，RsaI和Sau3A能有效区分来自木瓜的C. gloeosporioides和C. truncatum;AluI，ApaI，PvuII，RsaI和SmaI能有效区分来自辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum;PvuII，RsaI和Sau3A能有效区分来自木瓜的C.gloeosporioides，研究中使用多种限制性内切酶进行RFLP分析，主要是ITS高度保守而且种间序列差异较小。而本研究主要针对不同辣椒炭疽病菌的NIS1-RFLP分析，2种限制性内切酶Eco31I和SacI消化后的PCR产物差异片段数目和大小观察清楚，简便直观体现了不同辣椒炭疽病菌之间的差异，便于辣椒生产中炭疽病不同病原菌短时间内快速有效区分，可满足防控实际需要。但利用NIS1-RFLP对来自辣椒的相同种炭疽病菌进行分析，发现Eco31I和SacI消化后的PCR产物模式完全相同，与其NIS1基因序列分析结果完全一致，因此，针对辣椒C. gloeosporioides种内的遗传多样性，需要参照Ariana和Sephr（2012）的研究，选择不同的限制性内切酶，进一步优化PCR-RFLP体系。另外，本研究比较了来自橡胶、草莓和辣椒的胶孢炭疽病菌NIS1基因序列，尽管不同来源胶孢炭疽病菌NIS1基因序列的同源性为96%以上，但系统发育进化树上处于不同分支，表明NIS1基因也可作为胶孢炭疽菌种内遗传多样性的分子标记，但其RFLP体系需要选择不同的限制性内切酶来构建。

随着生物信息学的发展，病原真菌基因组数据越来越多，为真菌新的标记发展打下了基础。特别是广谱功能基因的研究，为其提供了相对详实的数据，便于新的分子标记研究;传统标记系统与新的标记系统融合，如NIS1基因标记与其他标记系统融合，为复合种群的区分提供更多的信息。值得期待的是，NIS1基因及其他致病功能基因是否可作为真菌种类鉴定的重要标记，需要对更多功能基因进行研究验证，从不同角度丰富真菌分子标记系统，相关研究工作目前正在进行中。

4 结论

本研究以辣椒炭疽病菌效应因子NIS1基因为靶标，成功发展了一种NIS1-PCR-RFLP标记系统，可快速有效区分侵染辣椒的C. truncatum、C. capsici、C. brevisporum、C. gloeosporioides和C. acutatum，明显优于rDNA-ITS标记系统。该方法具有特异性强，简便直观等特点，有望发展成为真菌新的分子标记应用于田间辣椒炭疽病菌种群的快速鉴定。

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（責任编辑 麻小燕）