油棕体细胞胚胎发生的研究进展

金龙飞 尹欣幸 曹红星

摘要：油棕（Elaeis guineensis Jacg.）是重要的热带木本油料作物，油棕种苗繁育方式主要有实生繁殖和无性繁殖。无性繁殖能够较好地保持亲本的优良性状，但油棕只有1个顶端生长点，常规的扦插、压条、嫁接等无性繁殖方式无法在油棕上应用，通过体细胞胚胎（体胚）发生进行组织培养是油棕种苗无性繁育的唯一途径。本文综述了油棕体胚诱导与培养、生理生化、解剖学、分子生物学、组学5个方面的研究进展，同时对油棕体胚发生的未来研究方向进行了展望，为油棕体胚发生的研究和组织培养技术的优化提供参考。

关键词：油棕;体细胞胚胎发生;体胚诱导与培养;生理生化;解剖学;分子生物学;组学

中图分类号： S718.43  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）13-0029-06

油棕（Elaeis guineensis Jacg.）是重要的热带木本油料作物，其果实压榨成的棕榈油除食用外，还广泛应用于食品加工业、轻工业、机械润滑、生物能源等领域[1]。油棕原产于非洲西海岸几内亚湾沿岸和刚果盆地的热带雨林，目前油棕栽培区域主要分布在东南亚、非洲的热带国家和地区[2]。由于油棕遗传结构的杂合度高，实生苗后代性状分离严重、株间差异大、产量和品质不稳定，采用常规杂交育种手段改良油棕种质进展缓慢[3]。无性繁殖能够有效地保持亲本的优良性状，然而油棕只有1个顶端生长点，扦插、压条、嫁接等常规无性繁殖技术都无法在油棕上应用，利用体细胞胚胎（以下简称体胚）发生进行组织培养是目前油棕唯一的无性繁殖途径[2，4]。通过组织培养获得的组培苗具有一致性好、管理方便、产量高等特点，其单位面积产量与实生苗相比可提高30%[5-6]。

油棕组织培养的研究始于20世纪60年代。20世纪70年代中期，研究人员首次采用幼嫩的茎尖分生组织作为外植体，通过离体培养获得油棕的组培苗[7-8]。1977年首批油棕组培苗在马来西亚试种成功，随后大量科研单位和油棕种植园开展油棕组织培养的研究。我国从20世纪80年代初开始油棕组织培养的研究，龚峥等首先采用叶片作为外植体获得了愈伤组织[9]，随后科研人员对油棕组织的培养基配方和培养条件进行探索和优化[10-13]。2011年我国获得了第1批油棕组培苗，2017年首批试种的油棕组培苗成功开花结果。油棕组织培养的难点和关键步骤是体胚发生，研究油棕体胚发生能够为优化组织培养的技术体系提供理论基础，同时也能深入认识油棕体胚发生的机理，而且组织培养是植物转基因和基因编辑等现代遗传改良技术的重要依托技术。本文综述了近年来油棕体胚诱导与培养、生理生化、形态解剖学、分子生物学、组学等的研究进展，并对今后的研究方向进行展望，以期为油棕体胚发生的研究和组织培养技术的优化提供参考。

1 油棕体胚诱导与培养

油棕体胚发生主要是通过间接体胚发生途径，先诱导愈伤组织，得到胚性愈伤组织后，再诱导体胚发生和增殖。愈伤组织诱导率较高，可达50%;而体胚的诱导率非常低，仅为3%～6%[5]。选择合适的外植体、基本培养基、植物激素和培养方式对油棕体胚诱导与培养至关重要。

1.1 外植体的选择

外植体是体胚发生的起始材料，选择合适的外植体对油棕体胚发生至关重要。外植体的选择须要考虑外植体的细胞分化程度、来源、取样难度、对母株的影响和组织培养操作的方便性等因素。油棕合子胚、根、幼叶、未成熟花序和顶端分生组织等不同组织和器官是油棕体胚发生的主要外植体。

合子胚的分化能力强，将其作为外植体具有取材、灭菌容易等优点，但合子胚是由生殖细胞发育而成，与母株的基因型不一致，培养出来的再生植株不能保持母株的优良性状，不能应用于商业化的组培苗繁育，但在油棕体胚发生的分子机制研究中有着重要的应用价值[14-15]。根尖初生分生组织分化程度较低，作为外植体具有旺盛的分裂增生能力，但是根尖取样困难，且附着大量细菌和真菌，灭菌困难，而且不同树体根系在地下交错不易区分[16]。未展开的幼嫩的叶片具有分生能力强、来源充足、灭菌容易等优点，是油棕组织培养的优良外植体，但采集未展开的幼嫩叶片对树体伤害极大，有可能导致树体死亡，而且取样次数不能过于频繁，一次取样后树体恢复需要2～3年[17-19]。未成熟花序作组织培养的外植体，具有分化能力强、来源充足，采集花序对树体伤害较小，容易灭菌等优点，是理想的外植体材料[20-21]。油棕顶端分生组织是植株最幼嫩的部分，作外植体具有分生能力强、分化率高、周期短等优点，但采集顶端分生组织会损害油棕地上部的唯一生长点，将对树体造成毁灭性的伤害[22]。还有研究发现，用組培苗作为外植体再进行组织培养，体胚发生率高于原株[23]。

外植体的甲基化状态与油棕体胚发生能力密切相关。Ho等研究发现，EgNB3在体胚发生能力强的外植体中的表达量和相对甲基化水平显著高于弱的外植体[24]。甲基化的状态还与油棕Mantled变异（一种多肉的类心皮结构取代雄蕊，并包裹在油棕果周围的突变体，含油量低）密切相关，位于EgDEF1基因第5个内含子上的Karma转座子的甲基化功能缺失是导致油棕组培Mantled变异的主要原因[25]。Sarpan等对油棕实生苗、正常组培苗和变异组培苗进行全基因组甲基化测序发现，EgDEF1的CHG位点低甲基化和1、2、3、5染色体的热点区域的低甲基化与Mantled变异密切相关[26]。

1.2 基本培养基的选择

不同培养基的营养成分和渗透压差别较大，选择合适的培养基对油棕体胚发生至关重要，MS培养基、N6培养基、木本植物用培养基（WPM）、Y3培养基在油棕体胚发生的研究中应用较多。姚行成等对MS、1/2MS、White、Nitsh、Y3、N6、MS大量+Nitsch微量+Morel & Wetmore维生素7种培养基对油棕组织培养情况进行比较分析，发现N6和 1/2MS 培养基效果较好[10]。Kerdsuwan等采用1/2 MS培养基和1/2 WPM培养混合配置的油棕培养基（OPCM）诱导油棕体胚发生，发现油棕在OPCM中的体胚发生率显著高于MS和WPM培养基[16]。邹积鑫等对MS、Y3、WPM 3种培养基在油棕体胚和次生胚诱导效果进行比较分析，发现培养基的种类对次生胚诱导的影响具有显著差异，其中WPM的诱导效果优于MS和Y3[12]。常见的油棕组织培养培养基配方见表1。

1.3 植物激素的选择

外源植物激素的种类、浓度和处理时间都会影响植物胚性愈伤组织和体胚的诱导、体胚的萌发和再生植株的形成[27]。油棕愈伤组织的诱导通常需要高浓度的生长素，而愈伤组织再分化形成体胚的过程通常需要降低生长素浓度或者完全不加生长素，同时需添加一定量的细胞分裂素、脱落酸和多胺。如表1所示，不同研究人员在油棕愈伤组织诱导过程中添加的生长素的种类较多，同一生长素的使用浓度差异也较大，大多数研究者认为棕榈科植物需要高浓度的生长素刺激才能诱导愈伤组织的产生[21-22，28]。Paranjothy等研究发现，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和萘乙酸（NAA）能促进油棕愈伤组织的诱导，细胞分裂素能抑制愈伤组织的诱导[29]。Jayanthi等研究发现，在愈伤组织分化形成体胚的过程中，毒莠定或毒莠定加2，4-D的体胚诱导率显著高于2，4-D或NAA[21]。然而邹积鑫等对毒莠定、2，4-D、麦草畏、NAA 4种植物激素在油棕初生体胚和次生胚诱导中的作用进行比较分析，却发现2，4-D对油棕体胚诱导率最高[12]。在油棕愈伤组织分化形成体胚过程中，在培养基中添加外源多胺（腐胺和精胺）能够显著提高体胚和次生体胚的诱导率[30-31]。因此，在油棕体胚发生的不同阶段，选择合适的植物激素并控制其浓度在适宜范围内是提高油棕体胚发生能力的关键因素。

1.4 培养方式的选择

早期研究中油棕的组织培养采用固体培养基，存在人工成本高、自动化程度低、培养周期长等缺点。获得愈伤组织后采用液体培养基悬浮培养和间歇浸没培养系统能够有效提高愈伤组织增殖效率，缩短体胚发生的周期[32-34]。此外，研究者还研发了MoFaTT、MoSLIM、SLIM-FaTT、MoVess、MoVeFast等一整套油棕液体培养技术和设备[35]。

2 油棕体胚发生的生理学研究

体胚发生过程中，外植体在植物激素的刺激下，内部的可溶性糖、氨基酸，以及代谢过程中的酶活性会发生明显的变化。沈雁等对油棕愈伤组织形成过程中的可溶性糖含量、脯氨酸含量、电导率、过氧化物酶活性进行测定，发现油棕愈伤组织增殖过程中可溶性糖含量先缓慢下降，然后迅速上升;脯氨酸含量先快速上升，然后急剧下降;電导率保持平稳;过氧化物酶活性逐渐下降[36]。Zou等对油棕胚性愈伤组织和成熟果肉中的脂肪酸含量进行比较分析，发现两者的总脂肪酸和甘油三酯含量非常相近，推测愈伤组织的脂肪酸含量可以作为预测分子育种果实含油量的重要指标[37]。油棕体胚发生过程中蛋白质、淀粉、内源激素等代谢物质的变化规律还有待于进一步的研究，进而为组织培养的优化奠定基础。

3 油棕体胚发生的解剖学研究

应用解剖学观察能够对油棕体胚发生过程的细胞、组织进行直观的描述和分析。油棕体胚发生过程中，外植体首先脱分化形成愈伤组织，成熟的胚性愈伤组织再分化形成体胚。Schwendiman等采用组织染色的方法对油棕体胚发生过程的组织解剖结构进行观察，发现愈伤组织首先从叶脉的伤口处长出，瘤状结构愈伤组织继续发育形成的胚性愈伤组织，进一步诱导形成体胚，而透明状的非胚性愈伤组织则不能发育成体胚[38]。Ong采用石蜡切片的方式对油棕体胚发生的解剖结构过程进行观测，胚性愈伤组织从初生的瘤状愈伤组织上发育而来形成原胚，该过程通常伴随着细胞壁加厚现象;原胚由几层高度液泡化的细胞包裹，非胚性愈伤组织则没有这些结构，而且看不到分生组织中心;将开始分化的胚性愈伤组织转移到生长素含量较低的分化培养基上，愈伤组织逐渐分化形成白色的不透明组织，进而形成体胚;胚性愈伤组织中维管组织和原始形成层的出现标志着胚性愈伤组织已经开始分化形成体胚[39]。随后茎尖在不透明的胚状体上长出，同时还伴随着头两片叶的生长，随着茎尖颜色逐渐变绿，叶片逐渐开始进行光合作用积累淀粉[5]。油棕的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的外观和解剖结构差异较大。Pádua等采用扫描电子显微镜和透射式电子显微镜对油棕愈伤组织的结构进行分析，发现胚性愈伤组织的细胞呈等径的圆球型排列成簇状，线粒体和高尔基体清晰可见，质体中积累大量的淀粉粒;而非胚性愈伤组织细胞细长且形状不规则，液泡占据整个细胞，细胞器较少[40]。

4 油棕体胚发生的分子生物学研究

植物体胚发生是一个具有次序和选择性的基因表达过程，受到一系列复杂的基因网络的调控[41]。随着分子生物学技术在油棕体胚发生研究中的应用，与油棕体胚发生相关的基因相继被克隆出来，基因芯片和高通量测序等技术也在油棕体胚的研究中得到应用。Morcillo等采用同源克隆的方式获得油棕的BBM类转录因子EgAP2-1，基因表达和原位杂交分析发现，EgAP2-1在合子胚和体胚中特异表达，在拟南芥中异位表达，能够增强转基因植物的体胚再生能力[42]。Ooi等克隆了生长素应答因子EgIAA9，基因表达分析发现，EgIAA9在胚性愈伤组织中的表达量显著高于非胚性愈伤组织，在体胚发生率较高的基因型中的表达量高于体胚发生率低的基因型，表明EgIAA9的表达量与体胚发生率呈正相关[43]。Ooi等研究发现，HD-Zip II转录因子EgHOX1主要在油棕胚性愈伤组织分生的中心和体胚的原形成层中表达，这表明EgHOX1在体胚发育的前期起正调控作用[44]。Lee等采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了油棕体胚发生受体激酶EgSERK1，基因表达分析发现，EgSERK1在叶片和愈伤组织中表达量较高，而且其表达量受到低浓度生长素的诱导;原位杂交分析发现，EgSERK1在叶片中脉的维管组织中含量较高，推测其在油棕愈伤组织起始阶段的信号传导中起重要作用[45]。Santos等利用体胚发生能力差异明显的杂交种B351733（强）和B352933（弱）为材料，对19个与体胚发生相关的基因在2个材料中的表达情况进行分析，发现在诱导的第14天时，这些基因在B351733中的表达量显著高于B352933，而在第30、90、150天则相反，这表明第30天可能是油棕体胚发生的关键临界期[46]。由于油棕的遗传转化体系还不成熟，这些克隆出来参与油棕体胚发生的基因未进行功能验证，也未在模式植物中进行功能验证，这也是油棕相关研究今后的研究重点。

5 油棕体胚发生的组学研究

随着基因芯片和高通量测序技术的发展，大规模基因和蛋白质的分离和鉴定成为可能，在油棕体胚发生的研究中也得到应用。Low等利用油棕的表达序列标签的序列信息开发出油棕DNA芯片，并对油棕愈伤发生和体胚形成过程的基因表达情况进行分析，获得3 584条基因，其中脂肪转移蛋白在胚性愈伤组织中高表达，谷胱甘肽-S-转移酶在非胚性愈伤组织中高表达[47]。Shariff等采用表达序列标签的方法分析了油棕体胚中特异表达的基因，获得32 545个转录本，注释分析显示16%的基因参与生理代谢，10%的基因参与蛋白质加工、修饰和贮藏，9%的基因参与细胞发育、衰老和抵御逆境胁迫，其中脂质转移蛋白WBP1A、体胚发生受体激酶SERK1和防御素基因EGAD1可能在体胚发生过程中起关键作用[48]。Pattarapimol等采用cDNA-AFLP技术对油棕体胚发生过程中的愈伤组织、球形胚期、鱼雷胚期、子叶期4个不同时期的基因表达进行分析，18个基因在体胚发生过程中差异表达，其中V型质子泵G亚基、乙酰辅酶A羧化酶和体胚发生类受体激酶、热应激蛋白、蛋氨酸氨肽酶、Ty3-gypsy逆转录转座子蛋白基因可能在体胚发生过程中起重要作用[49]。Chan等采用基因芯片在油棕中鉴定了编码结瘤素蛋白基因EgENOD93，该基因在胚性愈伤组织的表达量显著高于非胚性愈伤组织，对该基因进行RNA干涉后，转基因植株的体胚发生率降低50%，表明该基因正调控油棕的体胚发生[28]。

2013年马来西亚棕榈油局MPOB完成了油棕的全基因组测序工作，公布了非洲油棕和美洲的基因组序列，非洲基因组大小为1.535 GB，预测了 34 802 个基因;美洲油棕基因组大小为1.325 GB[50]。2016年新加坡国立大学完成了高产母本厚壳Dura基因组的高质量的序列测定和多个种质资源的基因组重测序以及进化分析[51]。基因组序列的公布为油棕基因挖掘和组学试验的开展奠定了基础[52-54]。Tan等采用比较蛋白组技术对分化效率差异明显的2个油棕材料进行分析，获得了27个差异表达蛋白[55]。Aroonluk等采用糖蛋白組学技术对油棕体胚发生的不同阶段的糖蛋白积累量进行分析，发现TIC40蛋白在球形胚期、鱼雷胚期和幼苗生长期积累量较高，认为该蛋白有望开发成分子标记用于体胚成熟的标记[56]。Ribeiro等采用蛋白组技术对体胚发生能力差异显著的油棕基因型愈伤组织诱导过程的差异积累蛋白进行分析，鉴定了221个差异积累蛋白，其中抗氧化和细胞分裂相关蛋白在愈伤组织诱导中起重要调控作用，有望开发成鉴定体胚发生能力的分子标记[57]。Aroonluk等采用磷酸化蛋白质组技术对油棕胚性愈伤、球形胚、鱼雷状胚、子叶状胚和再生幼苗5个发育阶段的材料进行分析，发现了10个在体胚发生中特异积累的蛋白，其中E3泛素连接酶和姐妹染色单体黏着蛋白Psd5有望开发成鉴定油棕体细胞胚发育成熟阶段的分子标记[58]。

6 展望

从20世纪70代年至今，油棕体胚发生的研究已经在体胚诱导与培养、生理生化、形态解剖学、分子生物学、组学5个方面取得了一定的研究成果，但仍然存在体胚分化率低、分化周期长、体细胞变异等问题。随着油棕基因组图谱的绘制完成[5-51]、组学技术和现代分子生物技术的在油棕研究上的应用[59-61]，油棕体胚发生研究今后可以从以下3个方面开展：（1）利用组学技术对油棕体胚发生过程中的关键基因、非编码RNA、蛋白质、代谢产物的积累规律进行研究，明确油棕体胚发生的分子机制;（2）采用转基因和基因编辑技术对已挖掘的油棕体胚发生相关的基因进行功能验证，明确这些候选基因在油棕体胚发生中的调控机制;（3）开展研究油棕体胚发生过程中的变异形成的分子机制，研发变异的快速检测技术。

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