甘蓝蔗糖磷酸合酶家族的鉴定和表达分析

山溪 秦文斌 张振超 姚悦梅 戴忠良 饶斌

摘要：蔗糖磷酸合酶（SPS）是调节植物蔗糖生物合成的关键酶。SPS由不同的基因编码组成，具有不同的表达模式和功能差异。利用拟南芥SPS蛋白保守结构域在甘蓝全基因组共鉴定到6个甘蓝SPS家族成员。进化分析结果表明甘蓝SPS基因分为3个亚族。6个BoSPSs家族成员被定位在甘蓝的5条染色体上。启动子顺式作用元件分析结果表明，BoSPSs含有许多与激素、逆境和光响应相关的顺式作用元件。RNA-Seq结果表明，BoSPSA1a在各个组织中均具有较高的表达量，BoSPSB除了在芽中表达量较高，在其他各个器官/组织中表达量均较低;冷敏甘蓝（CS-D9）和耐冷甘蓝（CT-923）中BoSPSA1b低温处理后均上调表达，且不同时间点耐冷甘蓝中的表达量均明显高于冷敏甘蓝。本研究结果有助于了解甘蓝SPS家族的信息，增加了对这些基因在甘蓝生长发育过程中及低温胁迫中所起的作用的理解。

关键词：蔗糖磷酸合酶;甘蓝;低温胁迫;BoSPSs基因;基因表达分析

中图分类号：S188+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0053-07

高等植物中，蔗糖是生命周期的基本要素，它主要由光合作用源组织产生，并被运输到吸收组织，然后作为各种代谢途径的碳源和能量源[1]。蔗糖可用于维持细胞代谢、细胞壁的生物合成、呼吸作用，或转化为淀粉供以后使用。参与蔗糖合成的重要酶是蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase，SPS），其中SPS催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖合成蔗糖-6-磷酸，这是调控植物蔗糖合成的重要步骤。SPS被认为是调控源叶和蔗糖库中蔗糖合成或积累的控制因子。SPS通过调节碳在淀粉和碳水化合物积累之间的分配，从而在碳水化合物代谢中发挥重要的作用[2-4]。已有研究表明，植物中有多种SPS的亚型，它们的表达随着发育、组织类型和环境信号的不同而呈现出差异性[5]。SPS受3种不同的机制调控：（1）基因表达[6];（2）葡萄糖-6-磷酸（激活剂）和无机磷酸盐（抑制剂）的变构调控[7];（3）可逆磷酸化共价修饰[6]。SPS在适应寒冷和干旱的器官/组织、黄化子叶、发芽的种子中受到调节[6]。在烟草的双杂交筛选中，发现2个14-3-3蛋白亚型与SPS相互作用，此外，缺失分析结果表明，SPS蛋白亲和力的差异是由14-3-3s的可变C末端介导的[4]。

SPS作为糖基转移酶超家族成员，有多种亚型存在[8-9]。目前，植物中发现有A、B、C、D等 4个SPS亚家族[10]。拟南芥中A家族有2个成员（AtSPSA1和AtSPSA2），AtSPSA1在光合作用合成蔗糖中有重要作用[11]，AtSPSA2主要参与花粉发育后期的蔗糖代谢[12]。烟草中C家族仅在源叶中表达，A和B家族在多个组织中均表达[4]。甘蔗和小麦中4个家族在不同组织中均具有差异性表达，甘蔗中B家族在幼叶和老叶中高表达[9]。

甘蓝属于十字花科芸薹属，营养丰富，适应性和抗逆性均较强，在我国年种植面积约90万hm2，在蔬菜供应中有重要地位[13]。本研究利用生物信息学分析，分离鉴定了甘蓝基因组中的SPS基因家族成员，并从全基因组水平上分析SPS基因结构、启动子顺式作用元件及其在染色体上的分布，探究BoSPS基因在响应低温中的作用。以期为进一步研究甘蓝SPS基因的功能和甘蓝蔗糖水平改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甘蓝SPS基因家族成员的鉴定

拟南芥的SPS基因来源于TAIR数据库（https：//www.arabidopsis.org/），白菜和甘蓝的基因组序列来源于BRAD数据库（http：//brassicadb.org/brad/）[14-16]，通过Pfam 33.1数据库（http：//pfam.xfam.org/）获取SPS含有的蔗糖合成酶（Sucrose-synth，PF00862）、糖基转移酶（Glycos-transf-1，PF00534）和蔗糖-6-磷酸水解酶（S6PP，PF05116）结构域的隐马尔科夫模型（HMM），利用hmmer（http：//www.hmmer.org/）软件在全基因组数据库中搜索同时含有这3个结构域的序列，并将此蛋白序列作为候选BoSPS序列。通过Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和NCBI batch CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）检测所有候选SPS蛋白序列的保守结构域，将同时含有3个结构域的蛋白序列作为甘蓝SPS基因家族序列[17]，剔除不含以上结构域或结构域不完整的序列。甘蓝BoSPSs基因根据其与AtSPSs序列的同源性及共线性关系添加后缀（a、b、……等）来命名。

1.2 甘蓝SPS蛋白序列特征预测和保守基序分析

使用ExPaSy在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對获得的甘蓝SPS蛋白质序列进行氨基酸数、分子量、理论等电点、脂肪族氨基酸数量和蛋白质疏水性进行分析[18]。使用CELLO v.2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）和Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）对甘蓝SPS蛋白进行亚细胞定位预测。使用模体分析工具MEME（http：//meme-suite. org/）对甘蓝SPS蛋白进行保守基序分析，其中最适基序宽度设置为6～50，最大基序设置为15，其他为默认参数。

1.3 甘蓝SPS基因系统进化分析和内含子/外显子结构分析

根据拟南芥中SPS基因亚家族的划分，使用MEGA 6.0软件，将拟南芥、白菜和甘蓝的16个SPS蛋白序列构建系统进化树，采用邻接法（Neighbor-joining），设置Bootstrap值为1 000，其他为默认参数。使用基因结构图绘制工具GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/），根据BoSPSs基因的编码（CDS）序列及其相对应的DNA序列，绘制BoSPSs基因外显子/内含子结构图。

1.4 甘蓝SPS基因染色体定位和共线性分析

根据BoSPSs基因在染色体上的位置分布信息，使用MapChart 软件绘制BoSPSs基因的染色体定位图谱。利用BRAD数据库分析甘蓝与拟南芥、甘蓝与白菜之间的直系和旁系同源基因关系，利用TBtools[19]绘制共线性图。

1.5 甘蓝SPS基因启动子区域顺式作用元件分析

利用New PLACE在线软件（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/）分析BoSPSs起始密码子上游2 000 bp序列中激素响应元件（ABRE、ERE、P-Box、TCA-Element、TGA-Element、TGACG-Motif）、胁迫响应元件（LTR、MBS、STRE、TC-Rich Repeats）和光响应元件（MRE、G-Box、GT1-Motif）等順式作用元件。

1.6 甘蓝SPS基因在不同器官/组织表达特性以及低温胁迫下的表达谱分析

根据甘蓝在不同组织/器官（愈伤组织、根、茎、芽、叶、花和角果）的RNA-Seq数据（SRA accession：GSE42891），本研究通过RPKM （reads per kilobases per million reads） 值来表示甘蓝SPS基因在不同器官/组织中的表达丰度，并绘制BoSPS的表达图。

冷敏甘蓝（CS-D9）和耐冷甘蓝（CT-923）的幼苗长到5张真叶时，转移至4 ℃的春化室进行低温处理（T），对照（CK）的幼苗仍处于正常生长条件（白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照14 h/黑暗10 h），分别对处理6、24 h的幼苗叶片进行取样，叶片剪碎后存储在-80 ℃冰箱中用于RNA-Seq分析。根据BoSPSs基因的FPKM值绘制其低温表达图。

2 结果与分析

2.1 甘蓝SPS基因家族成员的筛选及系统进化分析

在甘蓝基因组中筛选到6个BoSPS基因（表1），分别命名为BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3、BoSPSB、BoSPSC。这6个BoSPS蛋白序列中均含有蔗糖合成酶结构域、糖基转移酶结构域和蔗糖-6-磷酸水解酶结构域。这6个BoSPS蛋白序列的长度从872个氨基酸（BoSPSA1b）到1 065个氨基酸（BoSPSB），相对分子质量从97.11 ku（BoSPSA1b）到119.58 ku（BoSPSB），理论等电点从5.55（BoSPSA1b）到6.33（BoSPSA3），BoSPSs蛋白的理论等电点均在7以下，呈酸性形式存在。

BoSPS蛋白的亚细胞定位预测结果如表2所示，CELLO在线工具预测BoSPS蛋白均位于细胞质中，但是Cell-PLoc在线工具的预测结果表明BoSPS蛋白均位于叶绿体中。

将拟南芥、白菜和甘蓝的16个SPS蛋白序列构建系统进化树，系统发育分析结果（图1）表明，根据聚类将这些SPS蛋白成员分为3个不同的进化枝。其中，进化枝A包括BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2和BoSPSA3，进化枝B只有BoSPSB，进化枝C只有BoSPSC。

2.2 甘蓝SPS基因的染色体定位、基因结构和蛋白基序分析

6个BoSPSs基因分别被定位在5条染色体上（图2），其中，BoSPSA1b和BoSPSC锚定在染色体C02上，BoSPSA2定位在染色体C03，BoSPSB分布在染色体C05上，BoSPSA3定位在染色体C07，而BoSPSA1a在染色体C09上。根据甘蓝、白菜和拟南芥的共线性关系（图3），与拟南芥SPS基因相比，甘蓝和白菜中的SPS基因均没有丢失，在芸薹属特有的全基因组三倍化事件过程中均被保存了下来。且BoSPSA3和BrSPSA3在进化过程中特异性地存在于甘蓝和白菜中。其中甘蓝中的BoSPSA1a和BoSPSA1b，白菜中的BrSPSA1a和BrSPSA1b分别保留了双拷贝，而甘蓝中的BoSPSB和BoSPSC，白菜中的BrSPSB和BrSPSC均是单拷贝。

通过比较BoSPSs基因的CDS序列及其相应的基因组DNA序列，确定了BoSPSs的基因结构（图4），6个BoSPSs均含有11～13个外显子，除了BoSPSB，其他5个BoSPSs均含有13个外显子。BoSPSB在内含子丢失上存在差异，导致了其与其他BoSPSs在基因结构上的差异性。

使用MEME在线分析工具在BoSPS蛋白中预测出15个保守元件。结果（图5）显示，BoSPSA1b中无motif9和motif15;而仅BoSPSB具有motif11。其他BoSPSs在蛋白基序中均具有类似的结构。

2.3 甘蓝SPS基因启动子顺式作用元件分析

甘蓝SPS启动子序列中有许多与激素、逆境和光响应相关的顺式作用元件。通过PlantCARE数据库预测了BoSPSs成员中激素响应元件（ABRE、ERE、P-Box、TCA-Element、TGA-Element、TGACG-Motif）、胁迫响应元件（LTR、MBS、STRE、TC-Rich Repeats）和光响应元件（MRE、G-Box、GT1-Motif）等13个顺式作用元件。由表3可知，这些顺式作用元件在6个BoSPSs启动子序列中具有差异性分布，其中6个BoSPSs启动子区域均含有脱落酸响应元件（ABRE）。

2.4 甘蓝SPS基因转录组表达特性分析

甘蓝SPS基因组织/器官的转录组数据结果（图6）显示，相比于其他器官/组织，BoSPSA1a和BoSPSC在花中的表达量比较高，二者高水平的表达量在甘蓝开花期间能够确保甘蓝花中蔗糖的稳定合成;BoSPSA1a和BoSPSC在愈伤组织中的表达量比较高。甘蓝6个BoSPSs成员中，BoSPSA1a在花中的表达量最高;而BoSPSB在各个组织中的表达量均比较低，但在芽中表达量较高。BoSPSA1a在各个组织中的表达量均比较高。

由图7可知，低温处理6 h时，与对照相比，CS-D9 处理中BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2均明显上调表达，而BoSPSB则明显下调表达;CT-923中BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3均明显上调表达，而BoSPSB、BoSPSC则明显下调表达。低温处理24 h时，与对照相比，CS-D9中BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2 BoSPSB均明显上调表达，而BoSPSA3 BoSPSC则明显下调表达;CT-923中BoSPSA1a、BoSPSA1b BoSPSA2均明显上调表达，而BoSPSC则明显下调表达。

3 讨论与结论

随着越来越多植物基因组测序的完成，更多的SPS基因家族成员得到了分离鉴定[20-21]。大多數植物中编码SPS的基因为3～5个[22-23]，拟南芥中发现了4个，而白菜中有6个，玉米和大豆中发现了7个SPS基因[10，20]，陆地棉中发现了10个[24]。本研究在甘蓝全基因组水平上分离鉴定出6个BoSPSs基因，我们发现拟南芥、甘蓝和白菜中SPS基因的数量是不同的，拟南芥中有4个AtSPS基因，白菜中有6个BrSPS基因。其中，BoSPSs和BrSPSs均多于AtSPSs，但又不是理论上的3倍数量关系，这可能是芸薹属植株所特有的全基因组三倍化事件，以及后来发生的偏性基因丢失事件造成的[14]，而蔗糖物种中Ka/Ks的分子进化分析结果表明，多倍性降低了SPS基因的选择压力[25]。在拟南芥、甘蓝和白菜的共线性分析中，我们发现甘蓝与拟南芥发生分化之后，BoSPSAs保留了双拷贝，BoSPSB和BoSPSC均保留了单拷贝。通过基因结构和蛋白基序分析，我们发现甘蓝中各SPS基因均具有较大的差异，而外显子结构的差异在基因家族的进化中起着重要作用[26]。

Crof等对已知的SPS基因进行系统发育分析，将其分为4个不同的亚家族，其中，双子叶植物中有3个亚家族，分别为A、B、C亚族，而D亚族是单子叶植物所独有的[9]。本研究中BoSPSs可分为3个亚家族，BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3属于A族，这是双子叶植物和单子叶植物中SPS最大也是最重要的一个亚家族。许多植物中，A亚族的SPS基因在各检测器官/组织中均具有较高的表达量。张莉等在对甘蓝型油菜的研究中发现 BnSPSA1-2、BnSPSA1-3、BnSPSC-1和BnSPSC-2在叶片中表达量较高[27]。本研究中也发现BoSPSAs在7个器官/组织中（愈伤组织、根、茎、叶、芽、花和角果）均具有较高的表达量。

SPS基因的表达模式和生物功能在不同植物不同亚家族中存在差异性[28]。水稻的OsSPS1属于B亚族，仅在叶片的叶肉细胞、未成熟花序中表达[29-30]，甘蔗中SofSPSB（B族）在叶片中的表达量可以忽略不计，说明SofSPSB不参与蔗糖的合成[28]。本研究中，甘蓝BoSPSA1a在花中的表达量比较高，可能参与花中蔗糖的合成。据推测，SPSC在烟草中参与夜间代谢阶段的蔗糖合成[31];而苹果中MdSPS6参与叶片和果实发育后期的蔗糖合成[32]。玉米中的ZmSPS1、ZmSPS6和ZmSPS7在叶片中高表达，ZmSPS2在叶片和花粉中都有高表达，而ZmSPS3、ZmSPS4和ZmSPS5在所有组织中均表现出较低的组成表达，为维持不同组织对蔗糖的基本需求提供了依据[5]。甘蔗中D家族基因具有构成性表达，并在甘蔗中蔗糖合成发挥基本的功能。甘蓝BoSPSA1a和BoSPSA3在各个组织中均具有较高的表达水平，而同一亚族的BoSPSA1b在根中表达量很低。BoSPSC在角果和花中表达量比较高，说明它可能在种子发育时期与甘蓝产量的积累相关。在CS-D9和CT-923中，低温处理时，参与蔗糖合成的主要是进化枝A中的BoSPSs基因（除了BoSPSA3），均是上调表达，其中CT-923比CS-D9中BoSPSs基因的表达上调幅度更大。低温处理24 h时，BoSPSC基因的表达量明显下调。甘蓝SPS的活性与蔗糖的合成速率有关，这些结果表明，在低温胁迫下，耐冷甘蓝中的BoSPSs能促进蔗糖的合成，增强甘蓝的低温耐性。

在甘蓝全基因组中，通过分离鉴定得到6个BoSPSs，根据系统发育分析将BoSPSs分为3个亚族。该家族成员启动子区域的顺式作用元件与激素、逆境、光响应相关，基因的表达也具有明显的组织特异性，BoSPSA1a在各个组织中的表达量均较高，BoSPSB除了在芽中表达量较高，在其他各个组织/器官中表达量均较低。低温胁迫下，BoSPSA1a、BoSPSA1b和BoSPSA2的表达量均上调。推测这些BoSPSs基因可能在甘蓝低温响应中发挥了重要的作用。

参考文献：

[1]白蓓蓓，陈业渊，王 鹏. 植物蔗糖合酶家族基因鉴定及序列和进化分析[J]. 分子植物育种，2018，16（7）：2175-2179.

[2]Baxter C J，Foyer C H，Turner J，et al. Elevated sucrose-phosphate synthase activity in transgenic tobacco sustains photosynthesis in older leaves and alters development[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（389）：1813-1820.

[3]Lunn J E. Sucrose-phosphatase gene families in plants[J]. Gene，2003，303：187-196.

[4]Chen S，Hajirezaei M，Bornke F. Differential expression of sucrose-phosphate synthase isoenzymes in tobacco reflects their functional specialization during dark-governed starch mobilization in source leaves[J]. Plant Physiology，2005，139（3）：1163-1174.

[5]Lutfiyya L L，Xu N，Dordine R L，et al. Phylogenetic and expression analysis of sucrose phosphate synthase isozymes in plants[J]. Journal of Plant Physiology，2007，164（7）：923-933.

[6]Huber S C，Huber J L. Role and regulation of sucrose-phosphate synthase in higher plants[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1996，47：431-444.

[7]Doehlert D C，Huber S C. The role of sulhydyl groups in the regulation of spinach leaf sucrose phosphate synthase [J]. Biochimica Biophysica Acta，1985，93：353-355.

[8]Chen S，Hajirezaei M，Peisker M，et al. Decreased sucrose-6-phosphate phosphatase level in transgenic tobacco inhibits photosynthesis，alters carbohydrate partitioning，and reduces growth[J]. Planta，2005，221（4）：479-492.

[9]Grof C P L，So C，Perroux J M，et al. Research note：the five families of sucrose-phosphate synthase genes in Saccharum spp. are differentially expressed in leaves and stem[J]. Functional Plant Biology，2006，33（6）：605-610.

[10]Castleden C K，Aoki N，Gillespie V J，et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant Physiology，2004，135（3）：1753-1764.

[11]Sun J，Zhang J，Larue C T，et al. Decrease in leaf sucrose synthesis leads to increased leaf starch turnover and decreased RuBP regeneration-limited photosynthesis but not Rubisco-limited photosynthesis in Arabidopsis null mutants of SPSA1[J]. Plant，Cell & Environment，2011，34（4）：592-604.

[12]Jiang J，Zhang Z，Cao J. Pollen wall development：the associated enzymes and metabolic pathways[J]. Plant Biology，2013，15（2）：249-263.

[13]楊丽梅，方智远，庄 木，等. “十二五”我国甘蓝遗传育种研究进展中国蔬菜[J]. 中国蔬菜，2016（11）：1-6.

[14]Wang X W，Wang H，Wang J，et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nature Genetics，2011，43（10）：1035-1039.

[15]Liu S Y，Liu Y M，Yang X H，et al. The Brassica oleracea genome reveals the asymmetrical evolution of polyploid genomes[J]. Nature Communications，2014，5：3930.

[16]Cai X，Wu J，Liang J L，et al. Improved Brassica oleracea JZS assembly reveals significant changing of LTR-RT dynamics in different morphotypes[J]. Theoretical and Applied Genetics，2020，133（7）：3187-3199.

[17]强 毅.植物蔗糖磷酸合成酶的生物信息学分析[J]. 现代生物医学进展，2007，7（4）：557-560，570.

[18]Artimo P，Jonnalagedda M，Arnold K A，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（1）：W597-W603.

[19]Chen C J，Xia R，Chen H，et al. TBtools，a toolkit for biologists integrating various HTS-data handling tools with a user-friendly interface [J]. BioRxiv，2018：289660.

[20]Jiang S Y，Chi Y H，Wang J Z，et al. Sucrose metabolism gene families and their biological functions[J]. Scientific Reports，2015，5：17583.

[21]吕佳红，王英珍，程 瑞，等. 梨蔗糖合成相关酶SUS和SPS基因家族的鉴定与表达分析[J]. 园艺学报，2018，45（3）：421-435.

[22]Wang D，Zhao J，Hu B，et al. Identification and expression profile analysis of the sucrose phosphate synthase gene family in Litchi chinensis Sonn[J]. PeerJ，2018，6：e4379.

[23]魏清江，马张正，勒 思，等. 柑橘磷酸蔗糖合酶基因CsSPS的鉴定和表达[J]. 园艺学报，2020，47（2）：334-344.

[24]晁毛妮，胡海燕，付丽娜，等. 陆地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族的鉴定及表达分析[J]. 棉花学报，2020，32（1）：30-41.

[25]Ma P，Zhang X，Chen L，et al. Comparative analysis of sucrose phosphate synthase （SPS） gene family between Saccharum officinarum and Saccharum spontaneum[J]. BMC Plant Biology，2020，20（1）：422.

[26]Xu G X，Guo C C，Shan H Y，et al. Divergence of duplicate genes in exon-intron structure[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（4）：1187-1192.

[27]张 莉，荐红举，杨 博，等. 甘蓝型油菜蔗糖磷酸合酶（SPS）基因家族成員鉴定及表达分析[J]. 作物学报，2018，44（2）：197-207.

[28]Huang D L，Qin C X，Gui Y Y，et al. Role of the SPS gene families in the regulation of sucrose accumulation in sugarcane[J]. Sugar Tech，2017，19（2）：117-124.

[29]Chavez A T，Valdez J J，Martinez M，et al. Tissue-specific and developmental pattern of expression of the rice sps1 gene [J]. Plant Physiology，2000，124：641-653.

[30]Okamura M，Aoki N，Hirose T，et al. Tissue specificity and diurnal change in gene expression of the sucrose phosphate synthase gene family in rice[J]. Plant Science，2011，181（2）：159-166.

[31]Gibon Y，Blaesing O E，Hannemann J，et al. A robot-based platform to measure multiple enzyme activities in Arabidopsis using a set of cycling assays：comparison of changes of enzyme activities and transcript levels during diurnal cycles and in prolonged darkness[J]. The Plant Cell，2004，16（12）：3304-3325.

[32]李会霞，祝令成，张 钊，等. 苹果中磷酸蔗糖合酶家族基因的表达特性及其与蔗糖含量的关系[J]. 西北植物学报，2017，37（5）：872-878.