人参低聚肽对急性酒精中毒大鼠的作用研究

刘睿 任金威 陈启贺 李迪 毛瑞雪 刘欣然 乌兰 杜倩 李勇

摘 要：目的：评价人参低聚肽（ginseng oligopetides，GOPs）对急性酒精中毒大鼠的作用效果。方法：根据体重将大鼠随机分为酒精模型组、乳清蛋白组（250 mg/kg·BW）和4个GOPs剂量组（62.5、125、250、500 mg/kg·BW），另设1个正常对照组，每组10只。GOPs灌胃30 d后，以4 g/kg·BW浓度灌胃染毒造成大鼠急性酒精中毒模型（翻正反射实验为7 g/kg·BW），进行行为学实验（包括翻正反射、转棒和网上攀附实验）、检测血乙醇浓度，并检测大鼠肝脏乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）的活性。结果：GOPs干预能明显减少急性酒精中毒大鼠的翻正反射消失比率，延长网上攀附时间，增加醉酒大鼠在转棒上的停留时间，降低血乙醇浓度及提高肝脏ADH、ALDH活性。结论：GOPs可以通过加速酒精在体内的代谢，加强肝脏乙醇代谢酶活性，改善酒精引起的行为异常，从而对急性酒精中毒大鼠具有保护作用。

关键词：人参低聚肽;急性酒精中毒;翻正反射;酒精代谢酶

急性酒精中毒在日常生活中极为常见，尤其是在年轻人群中，醉酒造成了很多社会负面效应和健康问题[1-3]，因此探讨如何有效预防急性酒精中毒和保护机体免受急性酒精中毒的伤害已成为当务之急。2012年9月中国批准人参为新资源[4]。人参低聚肽（GOPs）是从人参中利用生物酶解技术分离得到的小分子生物活性肽类混合物，具有吸收快、水溶性高及粘度低等特点[5]。伴随着生物化学和分子生物学技术的飞速发展，有关低聚肽的研究正逐渐引起人们的重视。现代研究发现，低聚肽比单个氨基酸的吸收更有效，并能直接参与蛋白质的合成，有效提高了蛋白质的吸收利用率[6]。GOPs是安全性高且具有多种生理活性的功能性肽类物质，目前研究已证实，GOPs具有免疫调节、改善血脂异常、抗疲劳、耐缺氧、抗辐射、抗炎等多種生理作用[7-11]。本研究通过采用不同剂量的GOPs水溶液对大鼠进行为期30 d的灌胃干预，以多种行为学实验及血乙醇浓度变化为依据，评价GOPs对急性酒精中毒大鼠的作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

GOPs：为淡黄色固体粉末，主要以小分子寡肽为主，分子量小于1 000 Da的占97.39%，游离氨基酸含量为3.94 g/100 g，其中精氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸含量较多，购自吉林肽谷生物工程有限责任公司。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇（分析纯）、叔丁醇（分析纯），国药集团化学试剂北京有限公司;乳清蛋白，北京中柏公司（其蛋白含量为78%）;乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）检测试剂盒，北京麦格泰克科技有限公司;DXP-2大小鼠转棒仪，中国医学科学院药物研究所;低温高速离心机，德国Eppendorf公司;AdventurerTM通用型分析天平，美国OHAUS公司;数显电热恒温水浴箱，上海跃进医疗器械厂;352型酶标仪（芬兰，Labsystems Multiskan MS）;岛津 GC-2010 气相色谱仪。

1.3 实验动物及分组

SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠[体重（200±20）g]262只，由北京大学医学部实验动物中心提供（实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0010;实验动物使用许可证号：SYXK（京）2016-0041）。动物饲养在北京大学医学部实验动物科学部，动物实验环境设施（屏障环境）合格证书：医动字第 01-2055。饲养环境为屏障环境，温度为（22±2）℃，相对湿度为50%～60%，昼夜循环时间为12 h。动物实行分笼饲养，每笼3只，自由饮水、进食。

适应性喂养5 d后，根据体重将大鼠随机分为四大组，即翻正实验组、网上攀附实验组、转棒实验组和血乙醇浓度检测组;每个实验组再分为6个干预剂量亚组：即酒精模型组、乳清蛋白组（250 mg/kg·BW），GOPs低、中、高剂量组（62.5、125、250、500 mg/kg·BW），每个干预亚组10只大鼠（考虑到大剂量酒精容易造成大鼠死亡，翻正实验每组12只）。另设1个正常对照组（10只）。每日经口灌胃干预，正常对照组和酒精模型组给予蒸馏水，乳清蛋白组和GOPs剂量组给予相应浓度受试物（均用蒸馏水配制）。动物每周称重2次，根据体重及时调整灌胃量，干预时间为30 d。

1.4 方法

1.4.1 酒精灌胃造模 干预30 d结束后，各组动物禁食不禁水6 h后，分别用生理盐水（正常对照组和酒精模型组）、乳清蛋白水溶液、GOPs水溶液灌胃，30 min后，给予50%（v/v）酒精4 g/kg·BW（翻正实验剂量为7 g/kg·BW）灌胃造模，正常对照组给予等体积生理盐水（17.5 mL/kg·BW）。酒精灌胃30 min后，进行行为学实验（翻正反射、转棒和网上攀附实验）及乙醇浓度测定[12-13]。

1.4.2 翻正反射实验 50%（v/v）酒精灌胃后，将大鼠以背向下的姿势放于动物笼内，若大鼠在30 s内不能自主翻转过来，可认为其翻正反射消失（即为醉酒）;当大鼠可以自己翻转过来时，可认为其翻正反射恢复（即为醒酒），记录每组翻正反射消失的只数和死亡大鼠数。翻正反射实验结束后（超过16 h未醒者按16 h记录），和正常对照组一起乙醚麻醉，快速分离肝组织，进行ADH、ALDH活性的检测。

1.4.3 网上攀附实验 酒精灌胃染毒30 min后，将大鼠轻轻放在距地面15 cm的垂直金属网上。记录大鼠在网上攀附的时间，网上攀附时间超过30 min者记为30 min，直接从网上掉落者记为0。

1.4.4 转棒实验 大鼠醉酒后的平衡协调能力主要用转棒实验来评价。转棒仪的转速设为12 r/min，酒精灌胃染毒30 min后，将大鼠放在转棒仪上，使大鼠向转动棒的相反方向运动，从大鼠抓住转棒为起始点开始计时到大鼠从转棒上掉落为止。每只大鼠观察3次，以其中最长的一次作为该大鼠在转棒上的停留时间，30 min为观察终点。

1.4.5 血乙醇浓度的检测 在酒精灌胃后30、60、90、120、180 min时行内眦静脉采血，快速吸取0.2 mL移至顶空瓶内，并加入0.2 mL内标（叔丁醇溶液0.6 mg/mL）后，密封，采用顶真空气相色谱法测定醉酒大鼠不同时间点的血乙醇浓度。气相色谱仪条件：进样口：200 ℃;检测器：FID 220 ℃;载气：氮气（99.999%）;流速：10 mL/min;色谱柱：DB-WAX（30 mX 0.53 mm）;色谱条件：50 ℃起始保持2 min，10 ℃/min升温至60 ℃，20 ℃/min升温至100 ℃，40 ℃/min升温至200 ℃保持2 min。

1.4.6 肝组织ADH、ALDH含量的测定 在翻正实验结束后，乙醚麻醉处死大鼠，分离肝脏组织。取肝脏左外叶下段组织1 g 置于小烧杯中，加入6 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），冰浴中手动匀浆5 min，制成10%（w/v）的组织匀浆液，4 ℃，3 000 r/min离心20 min，取上清，根据ELISA试剂盒说明书检测样本中ADH、ALDH含量。

1.5 统计方法

用SPSS 24.0对数据进行分析。连续变量数据用均数±标准差（±s）表示，行单因素方差分析并采用LSD法进行组间的统计检验;非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 实验动物一般情况

在30 d的实验周期内，各实验组大鼠外观体征和行为活动、粪便性状、食量等均未见异常，无中毒体征及死亡。酒精灌胃后大鼠出现了明显的醉酒症状，在酒精模型组4 g/kg·BW剂量染毒的大鼠多表现为兴奋、共济失调、极度活跃、狂躁等，7 g/kg·BW剂量染毒的大鼠大多陷入昏睡期，反应迟钝，活动减少。GOPs各组大鼠精神状态及行为异常情况均好于酒精模型组和乳清蛋白组，随着干预剂量的增高表现情况越为好转，且大鼠的精神状况要好于乳清蛋白组。

2.2 GOPs对大鼠翻正反射的影响

如表1所示，干预30 d后，各组体重未观察到明显差异（P>0.05）。酒精模型组大鼠翻正反射消失比率达到了80%，且有2只实验动物死亡。与酒精模型组相比，GOPs各组随着干预剂量的增高大鼠翻正反射消失只数呈现出减少的趋势，其中GOPs（500 mg/kg·BW）组翻正反射消失的比率为16.67%，与酒精模型组相比差异具有显著性（P<0.01）。

2.3 GOPs对大鼠转棒停留时间的影响

如表2所示，各组间体重无显著性差异（P>0.05）。与酒精模型组相比，GOPs（125 mg/kg·BW）、GOPs（250 mg/kg·BW）和GOPs（500 mg/kg·BW）3组均能显著增加大鼠的转棒停留时间（P<0.01），30 min内转棒上未掉动物只数也多于酒精模型组。GOPs各组与乳清蛋白组相比無显著性差异（P>0.05）。

2.4 GOPs对大鼠网上攀附时间的影响

如表3所示，各组大鼠体重无明显差异（P>0.05）。各组大鼠网上攀附时间无统计学差异（P>0.05），但GOPs各组大鼠网上攀附平均时间长于酒精模型组和乳清蛋白组。

2.5 GOPs对大鼠血乙醇浓度的影响

如附图所示，GOPs干预有降低血中乙醇浓度的趋势。GOPs（250 mg/kg·BW）组在乙醇染毒90、120、180 min时，血乙醇浓度与酒精模型组相比明显降低，具有统计学意义（P<0.05）。GOPs（125 mg/kg·BW）组在乙醇染毒60 min时，血乙醇浓度明显低于乳清蛋白组（P<0.05）;120 min时，血乙醇浓度较酒精模型组明显降低，差异具有显著性（P<0.05）。

2.6 GOPs对肝组织ADH、ALDH活性的影响

如表4所示，与正常对照组相比，酒精模型组ADH含量明显增高，ALDH含量降低（P<0.05）。与酒精模型组相比，GOPs（125 mg/kg·BW）、GOPs（250 mg/kg·BW）、GOPs（500 mg/kg·BW）等3组ADH含量显著增高，GOPs（62.5 mg/kg·BW）、GOPs（125 mg/kg·BW）组ALDH含量明显高于酒精模型组（P<0.01）;与乳清蛋白组相比，GOPs（250 mg/kg·BW）、GOPs（500 mg/kg·BW）组ADH含量明显增高，GOPs（62.5 mg/kg·BW）、GOPs（125 mg/kg·BW）组ALDH含量显著增加（P<0.01）。

3 讨论

目前针对酒源性疾病的研究大多都是动物实验，酒精灌胃是目前应用最为普遍的造模方法[14]，但现阶段有关急性酒精中毒的报道中，酒精染毒剂量、时间、浓度等很多都不一致，增加了动物实验结果重复和比较的难度。Zhang F等[12]用体积分数为50%的乙醇按4 g/kg·BW的剂量给SD雄性大鼠一次性灌胃染毒后，观察到大鼠出现了明显的醉酒行为，如兴奋、蹒跚、共济失调等，以7 g/kg·BW剂量灌胃染毒后，大鼠翻正反射消失，进入了昏睡期。Liang J等[3]给SD雌性大鼠50%（v/v）乙醇5 g/kg·BW灌胃染毒后可观察到大鼠醉酒行为，7 g/kg·BW灌胃染毒后大鼠进入了昏睡期。综合以往研究，在大多急性酒精中毒动物模型中，乙醇染毒浓度为（4～7）g/kg·BW时，可以观察到动物出现醉酒行为，如兴奋、蹒跚、共济失调、昏睡等，浓度为7 g/kg·BW时，实验动物大多进入昏睡期[3，12，15-16]。在预实验阶段发现，当以4 g/kg·BW剂量酒精灌胃时，可以较为明显地观察到SD雄性大鼠醉酒行为，行为学实验结果较好;酒精灌胃剂量为7 g/kg·BW时，大鼠醉酒程度加深，大多陷入昏睡状态。因此，本研究通过灌胃给予大鼠50%（v/v）的酒精4 g/kg·BW（翻正反射实验为7 g/kg·BW）以造成大鼠急性酒精中毒模型，来探讨GOPs对急性酒精中毒大鼠的保护作用。考虑到肽是由蛋白质水解而来，除设立蒸馏水对照组外，另设了乳清蛋白作为蛋白质对照组，乳清蛋白是一种营养价值较高的优质蛋白，含必需氨基酸种类齐全、数量充足且比例适当，具有抗氧化、抗病毒、免疫调节等多种生理功能[17]。

急性酒精中毒按醉酒程度可分为兴奋期、共济失调期和昏睡期。翻正反射消失表明，实验动物进入了昏睡期，急性酒精中毒程度深，可将翻正反射消失时间即醉酒时间的长短作为评价药物干预效果的首要指标;网上攀附实验和转棒实验则可用于评价大鼠醉酒后动作协调、肌肉力量及平衡协调能力;血乙醇的浓度与急性酒精中毒大鼠的行为改变密切相关，检测血乙醇浓度的变化可以用来评价GOPs对乙醇代谢的影响[3，12-13]。本研究结果显示，GOPs能够减少翻正反射消失比率，酒精模型组80%的大鼠陷入了昏睡期，GOPs各组随剂量的增高陷入昏睡期的老鼠明显减少，较酒精模型组明显延迟了醉酒时间，在GOPs（0.500 0 g/kg·BW）组仅有2只陷入昏睡期，表明经30 d GOPs干预后能明显减少SD雄性大鼠醉酒率。网上攀附实验和转棒实验结果显示，GOPs干预可以延长醉酒大鼠网上攀附时间和增加大鼠在转棒上的停留时间。此外，GOPs干预还可以明显降低血清乙醇含量，除GOPs（0.062 5 g/kg·BW）组外，GOPs其余三组在各时间点的血乙醇浓度均低于酒精模型组和乳清蛋白组，其中GOPs（0.250 0 g/kg·BW）组在各时间点血乙醇浓度均最低，乙醇染毒后90、120、180 min时，血乙醇浓度与酒精模型组相比差异具有显著性（P<0.05）。以上结果表明，GOPs对急性酒精中毒具有明显的预防作用，还可以降低血乙醇的含量。

机体摄入的酒精90%在肝脏代谢，先由肝细胞内的ADH氧化为乙醛，再经ALDH氧化为乙酸，乙酸进一步分解为水和二氧化碳排出体外[18-19]。肝组织酒精代谢酶ADH和ALDH活性的加强可有效地促进酒精在体内的代谢[20]。本研究结果发现，与正常对照组相比，酒精模型组ADH含量显著升高（P<0.01），说明酒精摄入导致肝脏乙醇代谢酶活性增强，ALDH含量降低，表明ADH的高表达伴随降低的ALDH表达，提示了乙醛在肝脏的聚集，这与Yun J W等[20]的研究结果类似，他们给雌性野生型（wild-type，WT）小鼠以6 g/kg·BW酒精灌胃染毒，连续3次，每次间隔12 h，检测发现小鼠肝组织ADH显著升高。在GOPs干预组，除GOPs（0.250 0 g/kg·BW）组的ALDH活性低于酒精模型组外，GOPs各组ADH和ALDH活性均高于酒精模型组，且ADH含量在GOPs（0.250 0 g/kg·BW）、GOPs（0.500 0 g/kg·BW）组及ALDH含量在GOPs（0.062 5 g/kg·BW）、GOPs（0.125 0 g/kg·BW）组均显著高于酒精模型组和乳清蛋白组（P<0.01），表明GOPs干预提高了机体乙醇相关代谢酶的活性，促进了乙醇在体内的分解代谢，减轻了酒精及其代谢产物对机体的急性损害，对急性酒精中毒大鼠起到了保护作用。

综上所述，本研究以健康雄性SD大鼠为研究对象，通过50%（v/v）酒精灌胃染毒，探讨了GOPs对急性酒精中毒的影响，结果表明，GOPs干预能够明显减少大鼠翻正反射消失的比率，增加大鼠在轉棒上的停留时间，延长网上攀附时间，并降低血乙醇浓度，增加ADH、ALDH活性，促进乙醇的氧化代谢，表明GOPs具有一定的预防急性酒精中毒的作用，这对早期防治急性酒精中毒的发生及对机体的伤害有重要的意义。

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Effect of Ginseng Oligopeptides on Acute Alcoholism Rats

LIU Rui，REN Jin-wei，CHEN Qi-he，LI Di，MAO Rui-xue，LIU Xin-ran，WU Lan，DU Qian，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of ginseng oligopetides（GOPs）on acute alcoholism in rat.Method Based on the body weight，rats were randomly divided into alcohol model group，whey protein group（250 mg/kg·BW）and four GOPs intervention groups（62.5，125，250，500 mg/kg·BW），and plus a normal control group，ten animals in per group.After administration with GOPs for 30 days，4 g/kg·BW ethanol（7 g/kg·BW for loss of righting reflex test）was given by orally gavage.Ethanol levels in blood，behavioral studies including loss of righting reflex assay，rotarod test and climbing test，and alcohol dehydrogenase（ADH），acetaldehyde dehydrogenase（ALDH）activities in liver were assayed.Result GOPs intervention increased the time of climbing test and retarod test，reduced the rate of loss of righting reflex and alcohol level in serum，and increased ADH and ALDH activities in liver significantly.Conclusion GOPs treatment could promote the alcohol metabolism，enhance the activities of liver ethanol metabolizing enzymes and correct the movement disorder caused by alcohol consumption to some extent，thus having protective effect on acute alcoholism rats.

Keywords：ginseng oligopetides（GOPs）;acute alcoholism;loss of righting reflex assay;alcohol metabolizing enzyme

作者简介：刘 睿（1991— ），女，博士研究生，研究方向：营养与疾病。

通信作者：李 勇（1958— ），男，博士，教授，研究方向：营养与疾病。