GC法测定山核桃油中的酚类抗氧化剂的不确定度分析

摘 要：目的：建立气相色谱法测定山核桃油中酚类抗氧化剂的不确定度评定数学模型，分析试验中不确定度来源。方法：樣品经过乙酸乙酯稀释，采用气相色谱法测定山核桃油中BHA、BHT、TBHQ的含量，计算合成不确定度和扩展不确定度。结果：山核桃油中BHA、BHT、TBHQ的扩展不确定度分别为0.097、0.093 8、0.096 6 mg/kg（k=2，P=95%）。结论：影响3种抗氧化剂气相色谱法测定的不确定度来源主要是标准曲线溶液配制、标准曲线拟合和样品定容步骤，此不确定度评定可以提高检测结果的准确性。

关键词：山核桃油;抗氧化剂;BHT;BHA;TBHQ;气相色谱法

受阻酚类抗氧化剂是一种人工合成的油溶性抗氧化剂，在油脂中有良好的溶解性，能阻止或延缓食品氧化变质，延长食品货架期、保持食品品质[1]。我国GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》对特丁基对苯二酚（TBHQ）、二丁基羟基甲苯（BHT）和丁基羟基茴香醚（BHA）等受阻酚类抗氧化剂在油及食用油脂食品中的使用限量作出了明确的规定，限值均≤0.2 g/kg[2]。按照国家标准GB 5009.32—2016《食品中9种抗氧化剂的测定》[3]中气相色谱法检测时，为了排除实验室各种因素的影响，消除结果分散性，需对最后结果进行不确定度评估。本研究参考JJF 1059.1—2012 计量技术规范[4]、CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》[5]、CNAS-GL05《测量不确定度要求的实施指南》[6]中规定的方法和程序，选择山核桃油这类不饱和脂肪酸含量较高食用油，测定BHA、 BHT、TBHQ含量并对测量结果的不确定度进行评定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

山核桃油，超市购买;乙酸乙酯∶环己烷（1∶1，v/v）食品中抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ混合标准品，北京坛墨质检，浓度为1 000 μg/mL，不确定度2%（k=2）。环己烷，分析纯，北京化学试剂公司;乙酸乙酯，色谱纯，美国Fisher公司。2010PLUS气相色谱，日本岛津公司;Eppendorf-5810R多功能台式离心机，美国艾芬道夫公司;IKA MS3涡旋振荡器、IKA RV10旋转蒸发器，德国艾卡公司;Mattler ME204电子天平，瑞士梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 混合标准工作液的配制 配置浓度为200 μg/mL的标准乙酸乙酯储备液，然后分别吸取适量的标准储备液，用乙酸乙酯溶液稀释至浓度为5、10、25、50、100、200 μg/mL的混合标准使用液。

1.2.2 实测样品 准确称取在经分析不含上述抗氧化剂的山核桃油样品0.5 g（精确至0.1 mg），加入200 μg/mL混合标准液1 mL，即得实测样品。

1.2.3 样品前处理 提取：混合均匀的油脂样品，过 0.45 μm 滤膜后，准确称取0.5 g（精确至0.1 mg），用乙酸乙酯准确定容至10.0 mL，混合均匀待净化。同时做空白试验[3]。净化：得到的试样经凝胶渗透色谱装置净化，收集流出液蒸发浓缩至近干，用乙酸乙酯定容至2 mL，进气相色谱仪（GC）分析[3]。

1.2.4 仪器分析条件 GC配氢火焰离子化检测器（FID），DB-5MS毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;载气流速为1.2 mL/min;升温程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升温至250 ℃保持5 min;进样口温度230 ℃;检测器温度250 ℃;进样体积1 μL;不分流进样[3]。

1.2.5 测量数学模型 测量数学模型如式（1）：

X=C×V×1 000m×1 000（1）

式（1）中，X为样品中抗氧化剂的含量（mg/kg）;C为由标准曲线得出的提取液中抗氧化剂的质量浓度（μg/mL）;V为提取液的体积（mL）;m为样品称量的质量（g）。

2 结果与分析

本试验不确定度的分析来源包括标准溶液的配制过程及标准工作曲线的拟合、样品的称量及前处理过程、加标回收率等步骤。

2.1 标准溶液引入的不确定度urel1

标准溶液引入的不确定度主要包括标准品、标准溶液配制过程、标准曲线拟合步骤引入的不确定度。

2.1.1 标准品引入的不确定度urel1（e1） 根据标准品证书给出的混合标准品的扩展不确定度u（xi）均为2%（k=2），认为是矩形分布，则混合标准品的不确定度为式（2）：

urel1（e1）=u（xi）k=0.023=0.011 5（2）

2.1.2 标准曲线溶液配制引入的不确定度urel1（e2）混合标准品于一组10 mL容量瓶中定容，不确定度主要由10 mL容量瓶定容、移液枪的使用引入。

（1）定容引入的不确定度主要由容量允差和温度引入。按照JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[7]的要求，取玻璃量器对应的最大允许误差，假设为矩形分布，则标准溶液配制过程中由玻璃量器引入的不确定度0.02/3=0.011 5 mL。

试验所用玻璃量器已在20 ℃校准，而实验室的温度在±4 ℃之间变动。该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算。液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，液体的膨胀系数引起的不确定度。标准工作液是由乙酸乙酯稀释配制的，在20 ℃时的膨胀系数为1.38×10-3/℃，假设温度变化为矩形分布，由此计算的不确定度，则10 mL容量瓶引起的体积变化为±（1.38×10-3×10×4）=0.055 2 mL，不确定度为0.055 2/3=0.031 9。

由此可知，定容引入的不确定度u（F）=0.011 52+0.031 92=0.033 9 mL;相对不确定度urel1（e2-1）=0.033 9 mL/10 mL=0.033 9

（2）1 000 mL移液枪的不确定度由证书确定其扩展不确定度为0.2%（k=2），则相对不确定度urel1（e2-2）=0.0023=0.001 2。

综上所述，配制过程各使用6次，标准系列配制过程引入的相对合成不确定度见式（3）：

urel1（e2）=6urel1（e2-1）2+6urel1（e2-2）2=0.083 1（3）

2.1.3 线性最小二乘法标准曲线拟合引入的不确定度urel1（e3） 采用标准曲线检测1.2.2中样品时，用最小二乘法拟合标准工作溶液的质量浓度与峰面积曲线y=bo+bx，对应每个y测出对应的x值，由于y的（随机）变化性，x的赋值会产生误差。标准系列每个质量浓度测量1次，共6个质量浓度点，线性相关系数r大于0.999，样品山核桃油提取液测量2次，由最小二乘法拟合的标准曲线引入的标准不确定度按式（4）、（5）計算[5]，不确定度相关参数和计算结果见表1。

Sy=∑ni=1（yi-yfi）2n-2（4）

urel1（c）=Syb1p+1n+（xpred-）2∑ni=1xi-2;urel1（e3）=urel（c）xpred（5）

式（4）、（5）中，urel1（c）为待测溶液浓度C的标准不确定度;Sy为标准曲线的拟合标准偏差（μg/mL）;yi为标准曲线上各质量浓度点的峰面积;yfi为由回归方程计算得到各质量浓度点的峰面积;n为标准曲线上校准数据点的数目（n=6）;xi为标准曲线上各点的质量浓度（μg/mL）;为标准溶液的各质量浓度点的平均值（μg/mL）;b为标准曲线斜率;p为平行测量样品次数（p=2）;xpred为实测样品的平均质量浓度（μg/mL）;下标i表示第几个标准溶液。

综上所述，标准溶液引入的不确定度，按照式（6）分别合成山核桃油中各抗氧化剂的标准溶液的相对标准不确定度，则urel1-BHA值为0.090 3;urel1-BHT值为0.087 1;urel1-TBHQ值为0.090 0。

urel1-BHA=urel1（e1）2+urel1（e2）2+urel1（e3）2=0.090 3（6）

2.2 样品前处理过程引入的不确定度urel2

样品前处理过程引入的不确定度主要包括样品称量过程、样品定容过程、加标回收率引入的不确定度。

2.2.1 样品称量过程引入的不确定度urel2（e1） 根据天平的检定证书可知其最大允许差为±0.000 1 g，称量样品平均值为0.5 g，假设为矩形分布，则天平校准产生的不确定度为0.000 1/3=0.000 058 g，相对不确定度urel2（e1）=0.000 058/0.5=0.000 030。

2.2.2 样品定容引入的不确定度urel2（e2） 试验中样品定容10 mL，不确定度主要由容量瓶使用引入，假设为矩形分布，其来源主要是校准和温度引入，不确定度评定过程同2.1.2（1）。相对不确定度urel2（e2）为0.033 9。

2.2.3 加标回收率引入的不确定度urel2（e3） 回收率引入的相对不确定度属于A类不确定度评定范畴，通常采用贝塞尔法计算[8-9]。在经分析不含上述抗氧化剂的山核桃油中进行添加水平为25 mg/kg的加标回收试验，共6个平行样品（n=6），由回收率引入的相对不确定度见式（7），平均回收率（）、相对标准偏差（SD）及不确定评定结果见表2。

s（）=SDn; urel2（e3）=s（）（7）

综上所述，由式（8）合成由样品前处理过程引入的相对标准不确定度，则urel2-BHA值为0.036 5;urel2-BHT值为0.034 8;urel2-TBHQ值为0.035 2。

urel2=urel2（e1）2+urel2（e2）2+urel2（e3）2=0.036 5（8）

2.3 结果分析

以上各不确定度分量互不相关，由各分量 urel1（e1）、urel1（e2）、urel1（e3）、urel2（e1）、urel2（e2）、urel2（e3）可知，对抗氧化剂测定的不确定度评定影响最大的因素是标准曲线溶液配制引入的不确定度urel1（e2），其次是标准曲线拟合引入的不确定度urel1（e3）和样品定容引入的不确定度urel2（e2），其他3项对试验结果影响不大。合成相对不确定度urel为式（9）：

urel=urel12+urel22（9）

按照式（9）得到：urel-BHA=0.097、urel-BHT=0.093 8、urel-TBHQ=0.096 6，扩展不确定度为u（X）=2×urel（扩展因子k=2时，对应的置信概率为95%）。当检测1.2.2中的样品时，气相色谱法测定山核桃油中抗氧化剂结果表示为：WBHA=（338±0.097）mg/kg、WBHT=（362±0.093 8）mg/kg、WTBHQ=（344±0.096 6）mg/kg。

3 结论

本研究对气相色谱法测定山核桃油中酚类抗氧化剂的结果进行了不确定度评定，结果表明，不确定度最主要来源于标准曲线溶液配制步骤，其次为标准曲线拟合和样品定容步骤，其他分量在实际工作中可忽略不计。选用GB 5009.32—2016第四法气相色谱检测酚类抗氧化剂较为可靠，分析过程中的主要不确定度来源清晰，在今后的试验中，测量结果的不确定度评定可以只考虑其主要来源，这极大地精炼了不确定度评价过程。另外，为提高结果准确性，应主要控制以下两点：（1）严格控制实验环境，减小环境差异，使用检定合格的定量容器及移液枪，减小标准曲线溶液配制与样品定容步骤引入的不确定度。（2）选择适中的标准曲线范围，使待测样品的浓度在标准曲线中间，xpred-值趋于最小;并且增加被测物的平行测量次数，使p值变大，进一步减小标准曲线拟合步骤引入的不确定度。

参考文献

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[5]CNAS—GL006化学分析中不确定度的评估指南[S].北京：中国合格評定国家认可委员会，2019.

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Uncertainty Valuation on Determination of Phenolic Antioxidants in Pecan Oil by GC

MA Yan

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：Objective A mathematical model was established to evaluate the uncertainty of determination of phenolic antioxidants in pecan oil by gas chromatography，the sources of uncertainty was analyzed.Method The samples were diluted with ethyl acetate，and the BHA，BHT and TBHQ in pecan oil was determined by gas chromatography.Result The expanded uncertainties of BHA，BHT and TBHQ in pecan oil were 0.097 mg/kg，0.093 8 mg/kg and 0.096 6 mg/kg，respectively（k=2，P=95%）.Conclusion The main sources of uncertainty affecting the determination of three kinds of antioxidants by gas chromatography are the preparation of standard curve solution，the fitting of standard curve and the determination of sample volume.The evaluation of uncertainty can improve the accuracy of the test results.

Keywords：pecan oil;antioxidant;BHT;BHA;TBHQ;gas chromatography

作者简介：马妍（1983— ），女，硕士，副研究员，研究方向：营养与食品卫生。