HPLC法测定不同种类水果中的花青素含量

白沙沙 吕品鑫 顾海华 乔子纯 孔凡华 唐洪涛 崔亚娟 李东

摘 要：建立了水果中飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素等6种花青素含量的高效液相色谱测定方法，并对该方法的线性、精密度、回收率、稳定性进行了方法学验证。利用本方法测定了10种水果中6种花青素含量，结果表明：强酸溶液提取并水解得到花青素的处理方式稳定好、精密度高、回收率好，液相条件分离效果好，定量准确度高。10种水果测定结果表明，不同种类水果中花青素含量差异显著，花青素总量高的水果中6种花青素单体的含量差异显著，且不同种类水果中优势花青素单体不同。

关键词：水果;花青素;高效液相色谱法

目前已经确定的花色苷及花青素已有250多种，其中存在较普遍的有6类：飞燕草色素及其糖苷、矢车菊色素及其糖苷、矮牵牛色素及其糖苷、天竺葵色素及其糖苷、芍药素及其糖苷、锦葵色素及其糖苷[1-3]。花青素类基本结构为3，5，7-三羟基-2-苯基并吡喃，其邻苯二酚结构和多个羟基特性呈现出抗氧化、抗恶性肿瘤和抗炎等多种生理活性[4-7]。廖艳艳等[8]利用动物实验验证了蓝莓花青素对老龄大鼠的抗氧化效果和肝脏保护作用，证明了蓝莓花青素可以减少机体活性氧物质的积累并抑制凋亡基因的过度表达。Traustadóttir等[9]利用双盲随机安慰剂对照服用花青素的老年受试者研究结果表明，花青素可以降低缺血再灌注损伤诱导的血浆中F2-异前列腺素浓度和尿液中氧化核酸的分泌，提高老年人的抗氧化能力。

目前花青素的测定方法主要有分光光度法[10-12]、高效液相色谱法[13]、高效液相色谱串联质谱法[14-15]。分光光度法又分为单一pH值测定方法和pH值示差法。高效液相色谱法测定花青素含量目前有农业行业标准《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法 NY/T 2640—2014》，本方法是采用酸性乙醇溶液提取花青素和花色苷，沸水浴条件下水解花色苷为花青素，采用高效液相色谱仪对6种花青素进行分离后定性定量测定，其中各种花青素的有效分离是测定的关键点，所以本类方法在花青素分析种类上不具有优势。高效液相色谱串联质谱法在一定程度上弥补了液相方法的不足，通过液相条件的分离，母离子和子离子的定性定量测定，提高了目标物测定的灵敏度，可以同时测定几十甚至上百种化合物，在花青素和花色苷的测定中具有一定优势。本试验采用农业行业标准《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法 NY/T 2640—2014》研究不同水果中的花青素含量，为水果的消费和综合利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 水果样品采集与制备 （1）样品采集：本试验选择北京地区商超和农贸市场，通过现场采集和网购方式共收集到水果10种。（2）样品制备：采用四分法取样，每种水果进行可食部分离后，于高速匀浆机中匀浆处理。

1.1.2 主要试剂 （1）无水乙醇：色谱纯，Fisher公司;甲酸：色谱纯，Fisher公司;甲醇：色谱纯，Fisher公司;盐酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。（2）提取液：按照体积比进行配置，无水乙醇∶水∶盐酸=2∶1∶1。（3）飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素标准品：纯度96%，SIGMA-ALDRICH公司。（4）标准溶液的配置：准确称取各标准品并用10%甲酸甲醇溶液溶解定容，得到6种单标储备液。（5）混合标准工作液：分别移取6种单标储备液，稀释并定容，制备混标中间液，由混标中间液制备浓度为0.2～4 μg/mL的混合标准工作液。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：二极管阵列检测器，日立;电子天平：感量0.000 1 g和0.01 mg，Sartorius公司;超声波清洗仪：SPCC-80A，东莞谱标;恒温水浴锅：ZHWY-110X30，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 花色苷的提取

根据水果样品可食部颜色，适当称取一定量的水果匀浆于50 mL具塞三角瓶中，加入35 mL提取液，充分摇匀，超声提取30 min。

1.4 花色苷水解

提取完成后，置于沸水浴中水解1 h，取出后冷却，用提取液转移至50 mL容量瓶中并定容，此步骤是将花色苷水解为花青素，摇匀后静止，取上层清夜过0.45 μm滤膜，备用。

1.5 仪器测定与计算

采用250 mm*4.6 mm，5 μm的C18色谱柱进行分离，流动相为1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液梯度洗脱，检测波长530 nm，柱温35 ℃，进样量为10 μL，梯度洗脱条件见表1。混合标准工作液和样品制备溶液分别注入高效液相色谱仪进行分离和测定，以峰面积和对应浓度做标准工作曲线，外标法定量。

1.6 数据分析

利用Excel和SPSS分析软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 6种花青素单体标准曲线

以花青素标准工作液浓度为横坐标、仪器测定峰面积为纵坐标，得到工作曲线见表2。由圖1可知，6种花青素单体的线性相关系数均大于0.995，在测定范围内可以满足检测需要。

2.2 样品测定精密度

选择蓝莓样品和红颜草莓样品进行6次平行测定，考察本方法的样品测定精密度，结果显示，蓝莓样品中天竺葵色素未检出，飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药色素和锦葵色素的样品测定精密度RSD在3.46%～8.96%之间;红颜草莓样品中只检测到矢车菊色素和天竺葵色素，样品精密度RSD分别为3.34%和2.77%（表3）。这两种样品检测结果包含6种花青素单体，本方法前处理和液相条件测得蓝莓样品和红颜草莓样品精密度结果良好，适于水果中花青素的测定。

2.3 加标回收率结果

采用分析纯淀粉为空白底物，分别进行3个水平的加标测定，每个加标水平进行3个平行测定，验证本方法的加标回收率。表4可知，6种花青素单体的不同加标水平回收率在94.97%～116.50%之间，平行测定RSD为0.55%～8.97%，方法加标回收率良好，能够满足花青素含量测定的需要。

2.4 稳定性测定结果

为考察各花青素单体的稳定性，选取同一个样品上机小瓶在检测序列中每4 h测定1次，共进行6次测定，计算24 h内各花青素单体峰面积相对偏差，结果显示，避光常温放置条件下，各花青素单体稳定性良好，6种单体中矮牵牛色素6次测定峰面积相对偏差最大，为2.12%，各花青素单体具有很好的稳定性（表5）。

2.5 水果中花青素含量的测定

采集北京市场上10种具有颜色的水果，利用所建立的高效液相色谱法测定可食部中花青素含量，结果显示，10种水果中有蓝莓、黑桑葚、玫瑰香黑提、红颜草莓、冰鲜杨梅、樱桃共6种水果中均测定出了花青素含量，其中蓝莓花青素中的优势单体为矢车菊色素和芍药色素，黑桑葚和樱桃花青素中的优势单体为矢车菊色素，玫瑰香黑提花青素中的优势单体为锦葵色素，红颜草莓花青素中的优势单体为天竺葵色素。表6表明，黑桑葚花青素中含量最高的矢车菊色素结果为2 209 mg/kg，飞燕草色素含量仅为2.32 mg/kg，矢车菊色素和飞燕草色素含量相差近1 000倍，矮牵牛色素和天竺葵色素在黑桑葚中未测出。6种水果中均具有1种或2种优势花青素单体，6种花青素单体在此次采样的10种水果里并未同时检测出。在未测出的4种水果中，其呈色物质应为非花青素成分。黑美人西瓜和红麒麟西瓜果肉中未测定出花青素含量，与文献报道西瓜中呈色物质主要为番茄红素和β-类胡萝卜素结果一致[16];红肉火龙果果肉中的呈色物质为甜菜苷类[17];千禧圣女果中的呈色物质为番茄红素，属于类胡萝卜素[18]。

3 结论

强酸溶液提取并水解得到花青素的处理方式，能够很好地得到6种花青素单体的总量。方法学验证结果显示，蓝莓和红颜草莓6种花青素单体测定精密度RSD分别为3.46%～8.96%、2.77%和3.34%，结果均小于10%;不同水平加标回收率结果为6种花青素单体的不同加标水平回收率在94.97%～116.50%之间，平行测定RSD为0.55%～8.97%，能够满足样品中花青素含量测定的要求;液相条件分离效果好，定量准确度高，24 h内各花青素稳定性RSD小于2.12%;10种水果花青素含量差异大，6种花青素单体在10种水果中未同时检出，不同种类水果中优势花青素单体不同。其中，黑美人西瓜、红麒麟西瓜、红肉火龙果和千禧圣女果中并未检测出花青素含量。

4 讨论

花青素赋予水果丰富多彩的颜色，使水果呈现蓝色、红色、紫色等色彩。蓝莓、黑桑葚、红颜草莓等浆果类水果中花青素含量丰富，但并不是所有水果中的颜色均是花青素的作用，本研究中红色西瓜果肉、红肉火龙果果肉和圣女果中未检测到飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药色素和锦葵色素。本研究对10种水果中花青素含量的测定结果可以为消费者选购富含花青素的水果提供指导，为富含花青素水果的深加工和副产物利用提供科学依据。

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