萝卜AHP基因家族鉴定与表达模式分析

银珊珊 张宁 武春成 刘美妍 谢洋

摘    要：细胞分裂素在植物生长发育和抵御系列非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为了探讨萝卜（Raphanus sativus L.）细胞分裂素信号转导途径中组氨酸磷酸转运蛋白（AHP）的生物学功能与表达模式，对萝卜AHP基因家族成员的数量、进化关系、顺式元件、基因结构、发育及非生物胁迫下基因表达模式进行分析。结果表明，萝卜AHP基因家族有6个成员，其中RsAHP2和RsAHP5为片段重复基因，RsAHP3和RsAHP4为串联重复基因;系统进化分析发现萝卜、拟南芥和白菜的AHP家族具有同源性;其启动子序列中含有光响应、激素响应和防御应激等顺式作用元件;萝卜AHP均在根中表达量高而在叶中表达量低;不同非生物胁迫条件下，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5差异表达显著。研究结果可为解析萝卜AHP基因功能提供理论依据。

关键词：萝卜;组氨酸磷酸转运蛋白;非生物胁迫;基因表达

中图分类号：S631.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）08-007-08

Identification and expression pattern analysis of AHP gene family in radish

YIN Shanshan， ZHANG Ning， WU Chuncheng， LIU Meiyan， XIE Yang

（Hebei Key Laboratory of Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization/College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China）

Abstract： Cytokinins play important roles in plant growth and development and resistance to a series of abiotic stresses. In order to explore the expression pattern and function of histidine phosphate transporters （AHP） of cytokinins signal transduction pathway in radish（Raphanus sativus L.）， the number of members， evolutionary relationships， cis element， gene structure， and gene expression patterns of radish AHP genes family under development and abiotic stress were analyzed . A total of six members in the AHP gene family of radish， and RsAHP2 and RsAHP5 were fragment duplicates， and RsAHP3 and RsAHP4 were tandem duplicates. Phylogenetic analysis showed that the AHP family of radish， Arabidopsis and Chinese cabbage share homology. There were many cis-acting elements in the promoter sequence of AHP gene in radish， which are resposive to light response， hormone response and stress response. The expression level of AHP gene family was high in roots but low in leaves. Under different abiotic stress conditions， RsAHP1， RsAHP2 and RsAHP5 in radish were significantly differentially expressed.The results could provide a theoretical basis for analyzing the function of AHP in radish.

Key words： Radish; Histidine phosphate transporter; Abiotic stress; Gene expression

細胞分裂素是六类重要植物激素之一，在细胞周期中起着重要作用，影响植物的生长发育[1]。细胞分裂素除了可以促进植物细胞分裂和生长发育外，还通过抑制植物中叶绿素、核酸、蛋白质等物质的分解，将必需的氨基酸、激素、无机盐等化合物重新分配到植物的其他部位，从而阻碍植物衰老[2]。越来越多的研究表明，细胞分裂素可以减轻胁迫对植物造成的伤害，但还不清楚在逆境胁迫下细胞分裂素响应逆境的分子作用机制[3]。

在植物体内细胞分裂素信号传递是利用了一种类似于细菌中的双元组分系统进行的[4]。在细胞分裂素信号传导过程中，磷酸基团的传递主要是通过3种蛋白协同完成，即组氨酸蛋白激酶（histidine kinases， HK）、磷酸转移蛋白（arabidopsis histidine phosphotransfer proteins， AHP）以及反应调节因子（response regulators， RR）[5]。其中AHP是在受体组氨酸激酶和反应调节因子之间调控磷酸的转移，AHP上保守的组氨酸位点接受来自细胞分裂素受体HK的磷酸基团后，从细胞质进入细胞核，随后将磷酸基团转移并定位于细胞核的反应调节因子RR上，从而激活下游基因的表达以完成信号传递[6]。

目前，对水稻、拟南芥、小麦、玉米等多种植物中的AHP基因家族研究较多[7-11]，但对萝卜中的AHP基因家族还未有系统的研究。拟南芥的AHP1-5保守结构基序为XHQXKGSSXS，存在可被磷酸化的组氨酸残基。AHP6中组氨酸（H）被天冬氨酸（N）代替，不具备磷酸转移蛋白的活性，且对磷酸基团的传递起负向调控作用[12]。拟南芥中组氨酸磷酸转运蛋白基因AHP2、AHP3和AHP5均受盐、干旱和ABA抑制表达，其三重突变体ahp2，3，5对盐和干旱的耐受性也显著高于野生型对照[13];拟南芥中AHP4对花药内壁次生细胞壁的增厚为负调控[14];拟南芥中AHP1、AHP2、AHP3在根中表达量多，在叶和茎中表达量很少[15];拟南芥中AHP2、AHP3、AHP5是细胞分裂素信号通路中CKI1下游促进拟南芥雌配子体发育的主要因子[16]。在水稻中对AHP基因的研究表明，OsAHP1和OsAHP2受干旱抑制表達，其RNAi植株对干旱的耐受性也显著高于野生型对照;相反，OsAHP1受盐诱导表达，其RNAi植株对盐的耐受性显著低于野生型对照[17];在小麦中对AHP基因的研究表明，TaHP1在地上部上调表达，并对叶片衰老有抑制作用[18]。以上研究结果为筛选和鉴定萝卜AHP基因家族及其相关研究提供了重要的思路。

萝卜是重要的世界性蔬菜作物之一，属十字花科一、二年生草本植物。非生物逆境如重金属、盐、热、干旱、低温和弱光等是限制萝卜高效生产和育种的重要因素。AHP基因家族在植物生长发育的各个方面和对逆境的响应过程中都有参与[19-21]，因此笔者对萝卜AHP基因家族进行鉴定，系统分析其氨基酸特性、进化关系、顺式作用元件、基因结构，并对其在不同时期不同组织和非生物胁迫下的表达模式进行分析，研究结果将为进一步研究RsAHP的基因功能和提高植物的非生物胁迫耐受性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与非生物胁迫处理

试验于2021年2—3月在秦皇岛河北科技师范学院园艺实验楼人工气候室内进行。将潍县萝卜（潍坊市农业科学院育成品种，购于昌邑市永昌种业有限公司）播种于V草炭∶V蛭石∶V珍珠岩=3∶1∶1的混合基质的营养钵中，在温室中培养，温度为25 ℃/16 ℃（昼/夜），光周期14 h（光）/8 h（暗）。将25 d 苗龄的幼苗进行不同胁迫处理：干旱（3 d，田间持水量50%，中度干旱）、冷害（4 ℃，36 h）、遮光（3 d，完全遮光）和对照。采用完全随机设计，每处理3次重复，混合取样，收集处理后的叶子取0.2 g用于后续 RNA 提取。

1.2 试验方法

1.2.1 萝卜AHP基因家族成员鉴定与蛋白理化性质分析 利用Pfam在线软件 （http：//pfam.xfam.org/） 检索拟南芥AHP蛋白，获取AHP结构特征序列的种子文件PF01627，随后通过HMMER 3.0软件以该种子文件为索引在萝卜数据库中检索，获得与该蛋白结构特征相匹配的序列，即为萝卜AHP家族候选成员[22]。利用NCBI （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线网站blastp验证已获得的萝卜AHP家族候选成员，具有AHP结构域的候选蛋白即为萝卜AHP家族成员，将编码这些蛋白质的基因定为RsAHP 基因。将萝卜AHP家族成员的蛋白序列提交至ExPASy在线网站（http：//web.expasy.org/protparam/），运行ProtParam程序，预测蛋白的相对分子质量、理论等电点、不稳定系数、亚细胞定位和三级结构等相关的理化性质。

1.2.2 萝卜AHP基因家族染色体定位与共线性分析 利用Map Inspect软件分析AHP家族基因在染色体上分布情况。在萝卜基因组内进行 BLASTP 搜索（E< 1×10-5），利用 MCScanX 软件进行共线性区块预测（阈值 ≤ 1×10-5）[23]。

1.2.3 萝卜AHP基因家族系统进化树构建 分别在萝卜、拟南芥tair和Brassica数据库（http：//brassicadb.org/brad/geneFamily.php）下载萝卜、拟南芥和白菜全基因组数据，获取萝卜、拟南芥和白菜AHP基因家族的蛋白序列，利用MEGA 6.0软件，采用Neighbor-Joining方法，构建系统进化树。

1.2.4 萝卜AHP基因顺式作用元件预测 从萝卜基因组数据库中提取 RsAHP 基因上游 1000 bp 序列，提交至 PlantCARE 数据库，用于基因启动子区顺式作用元件分析。

1.2.5 萝卜AHP家族成员基因结构和保守结构域分析 利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线软件展示萝卜AHP基因家族各成员的基因结构信息;利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）网站在线分析该家族共有的保守结构。

1.2.6 萝卜AHP基因的表达模式分析 植物总RNA提取和反转录分别使用RNAprep Pure Plant Kit和FastKing RT Kit（With gDNase）（天根，中国），依据产品说明书提取植物总RNA，检测合格后反转录为cDNA。引物设计利用Beacon Designer 7.0 软件设计（表1），内参基因由南京农业大学萝卜课题组提供。按照Super PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（天根，中国）操作步骤加样，在 LightCycler? 480 实时荧光定量系统（Roche，Germany）中进行实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）及数据分析。利用前人报道的萝卜RNA-Seq数据信息，获取萝卜生长发育不同阶段（7 、14 、20 、40 、60 、90 d）不同组织（皮层、形成层、木质部、根和叶片） [24]以及盐胁迫[25]、热胁迫[26]、铬胁迫[27]、铅胁迫[28]和镉胁迫[29]等胁迫下AHP家族基因及其表达量数据信息。基因表达水平用RPKM值表示，利用Cluster 3.0和Tree View软件进行萝卜AHP家族基因表达量的热图制作。

2 结果与分析

2.1 萝卜AHP基因家族成员鉴定、染色体定位与共线性分析

在萝卜基因组数据库中，总共检索到7条与AHP结构序列特征相匹配的蛋白序列（E-value < 0.01）。去除序列结构不完整蛋白（无起始密码子或终止密码子）和在NCBI中blastp （检索物种Raphanus sativus L.和Arabidopsis thaliana）注释信息都不是AHP结果的蛋白，最终确定6个AHP蛋白。根据序列匹配值由高到低，依次命名为RsAHP1～ RsAHP6。萝卜AHP蛋白的分子质量（MW）在17.3～19.9 kDa范围内，除了RsAHP（19.9 kDa）MW值在19 kDa以上，其余各蛋白MW值分布集中在17.3～17.6 kDa。理论等电点pI值分布在4.88～5.92之间不等，属于酸性蛋白。不穩定系数平均值为37.1（< 40.0），这说明AHP蛋白结构偏稳定。预测萝卜AHP蛋白均为亲水性蛋白，并且亚细胞定位于细胞核上（表2）。

利用Map Inspect软件分析AHP家族基因在染色体上的分布情况。基因RsAHP2、RsAHP5和RsAHP6分别成功定位到萝卜Chr1、Chr4和Chr9号染色体上，另外3个基因RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4均未定位到9条染色体上，其中RsAHP2和RsAHP5属于片段重复基因，RsAHP3和RsAHP4属于串联重复基因（图1）。

2.2 萝卜AHP基因家族系统进化分析

为揭示萝卜AHP蛋白与十字花科作物拟南芥和白菜的AHP蛋白在进化上的位置与亲缘关系，利用MEGA 7.0软件对萝卜（Rs）、拟南芥（At）和白菜（Bra）的AHP蛋白序列构建系统进化树。由图2可知，萝卜、拟南芥和白菜AHP家族蛋白可以分为4个大的亚群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ），其中Ⅰ类亚群（11个成员）中，萝卜RsAHP1、RsAHP2、RsAHP5和RsAHP6分别与白菜Bra028236/拟南芥AtAHP3、白菜Bra025394/拟南芥AtAHP2、白菜Bra036215/拟南芥AtAHP2和白菜Bra033398/拟南芥AtAHP5亲缘关系最近;Ⅱ类亚群（4个成员）中，萝卜RsAHP3和RsAHP4与白菜Bra023876/拟南芥AtAHP1亲缘关系最近;而Ⅲ类亚群（3个成员）和Ⅳ类亚群（2个成员）均没有萝卜RsAHP家族成员。

2.3 萝卜AHP基因顺式作用元件分析

为了解萝卜AHP基因的表达调控方式，笔者利用PlantCARE软件对该基因家族启动子区（ATG上游1000 bp）的顺式作用元件进行分析，结果如表3所示，预测到的顺式作用元件除了CAAT-box和TATA-box外，还包括激素响应（7种，AuxRE、GARE-motif、TGA-element、ABRE、TGACG-motif、TCA-element、CGTCA-motif）、防御应激与胁迫响应（4种，TC-rich repeats、STRE、MYB、MYC）、干旱诱导（MBS）、光响应（12种，ATC-motif、Gap-box、TCT-motif、Box 4、G-Box、GT1-motif、GA-motif、LAMP-element、GATA-motif、ACE、AE-box、chs-CMA1a）以及低温响应（LTR）等44种作用元件。其中激素响应元件、胁迫响应元件和光响应元件所占比率较高，说明激素调节、光环境和胁迫刺激在植物生长过程中发挥重要的作用。其中，RsAHP1～RsAHP5序列中包含STRE和MYB胁迫响应元件，RsAHP1、RsAHP2、RsAHP5、RsAHP6序列中包含MYC胁迫响应元件，以上这些顺式作用元件的表达与萝卜耐胁迫生长密切相关。

2.4 萝卜AHP家族成员基因结构和保守结构域分析

利用GSDS和MEME网站分别在线分析萝卜AHP家族成员基因结构和保守结构域特征。由图3可知，除RsAHP6基因含有7个外显子和6个内含子外，其余RsAHP基因均只含有6个外显子和5个内含子;萝卜AHP家族蛋白均含有4个保守基序（Motif），即Motif1、Motif2、Motif3和Motif4。

2.5 萝卜AHP基因在发育和非生物胁迫下的表达模式分析

基于Mitsui等[24]报道的RNA-Seq数据，提取RsAHPs家族基因在萝卜生长发育不同阶段和不同组织中的RPKM表达量数据信息，利用Cluster 3.0软件对其进行聚类分析和Treeview软件展示聚类结果。结果显示，RsAHPs家族基因均在叶中表达量低，根中表达量高，尤其RsAHP5表达量最高，RsAHP2表达量次之，RsAHP3和RsAHP4表达量最低;其中RsAHP5在皮层、木质部和形成层中表达量最高，RsAHP2在根中任意组织中表达量均相当，而RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4则是在根尖中表达量最高（图4-a～b）。此外，通过维恩图分析发现，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5在萝卜根尖、木质部、形成层、皮层和叶片中都高表达（RPKM > 5）（图4-c）。

利用前人发表的萝卜转录组数据库，获取盐胁迫、热胁迫、铬胁迫、铅胁迫和镉胁迫等非生物胁迫下AHP家族基因及其表达谱信息（归一化表达水平）。结果表明，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5均响应盐胁迫、热胁迫、铬胁迫、铅胁迫和镉胁迫，且其表达模式略有差异。例如，RsAHP1在热胁迫、铬胁迫、铅胁迫和镉胁迫下均下调表达，而在盐胁迫下为上调表达;RsAHP2在盐胁迫、铬胁迫、铅胁迫和镉胁迫下均上调表达，而在热胁迫下为下调表达;RsAHP5在盐胁迫、铬胁迫、铅胁迫和热胁迫下均上调表达，而在镉胁迫下为下调表达（图5）。此外，RT-qPCR分析发现干旱胁迫下RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4均显著上调表达，较对照组表达量高5～9倍;RsAHP3和RsAHP4均对冷害与遮光无响应，而RsAHP6对遮光响应显著且上调表达（图6）。综上，萝卜AHP家族基因可能在响应干旱、盐、铬、铅、镉等非生物胁迫方面表现出重要作用。

3 讨论与结论

萝卜是十字花科重要的根菜类蔬菜作物，是我国出口创汇的蔬菜之一[30]。萝卜的产品器官肉质直根是一种复合器官（变态器官），除了具有植物学根的特性以外，还有下胚轴发育而来的膨大肉质直根[31]。萝卜肉质直根膨大形成发育的好坏直接关系到最终的产量与品质的高低[32]。实质上，萝卜肉质直根膨大形成是由细胞分裂（细胞数目）与细胞膨大（细胞体积）决定的，而细胞分裂素的合成、代谢与信号转导在萝卜肉质直根膨大形成过程中起到重要的作用[33]。研究已证实，AHP是细胞分裂素信号转导过程中的重要调节因子，可以将来自组氨酸激酶HK的磷酸基团转移至位于细胞核的反应调节因子RR上，从而激活下游基因的表达以完成信号传递[6]。因此，开展萝卜AHP基因家族鉴定与功能分析等相关研究对于萝卜品质育种有重要理论意义。

随着新一代测序（NGS）技术广泛应用，生物组学（omics）数据大量涌现。利用生物信息学技术将这些庞大数据信息进行有效整合，将为挖掘植物重要性状相关基因提供理论基础[34]。笔者以萝卜为研究对象，利用生物信息学技术，鉴定出6个萝卜AHP基因家族成员（RsAHP1～RsAHP6）。其中，RsAHP2、RsAHP5和RsAHP6分别定位到萝卜Chr1、Chr4和Chr9号染色体上，存在片段重复（RsAHP2/RsAHP5）和串联重复（RsAHP3/RsAHP4）基因对，这对于萝卜AHP基因家族的扩张和植物更好地适应外界环境变化提供了遗传基础。同时为了探究萝卜AHP基因作用机制，分别提取萝卜AHP家族基因的起始密码子（ATG）上游1000 bp序列进行顺式作用元件分析。启动子序列分析表明激素响应元件（7种，4/6）、胁迫响应元件（4种，6/6）和光响应元件（12种，6/6）种类所占比率较高、覆盖萝卜AHP家族成员个数较多，说明激素调节、光环境和胁迫刺激在萝卜肉质根生长发育过程中的物质形态建成、激素和胁迫信号转导等方面发挥重要的作用。

为了探究萝卜AHP基因在植物发育不同时期不同组织及系列非生物胁迫条件下的功能，笔者对其在萝卜生长发育不同阶段和不同组织以及盐、热、铬、铅、镉、干旱、冷害、遮光胁迫下的表达谱进行综合分析。拟南芥中的AHP1、AHP2、AHP3在根中表达量多，在叶和茎中表达量很少[15]，基因表达谱分析表明萝卜AHP家族基因均在叶中表达量低，根中表达量高，这与前人研究结果一致，尤其是RsAHP5在萝卜皮层、木质部和形成层中表达量最高，而RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4在萝卜根尖中表达量最高，说明萝卜AHP家族基因具有时空表达特性，且RsAHP5可能在萝卜肉质根膨大形成过程中细胞分裂素信号转导起到重要作用。非生物胁迫条件下，萝卜转录组分析表明RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5均显著差异表达，表明这些基因响应了盐、热、铬、铅和镉胁迫。在盐胁迫条件下，拟南芥AtAHP2、AtAHP3和AtAHP5均受抑制表达，这与本研究中萝卜RsAHP2和RsAHP5的表达模式相一致，但是与RsAHP1表达模式相反[13];水稻OsAHP1受鹽胁迫诱导，并且其RNAi植株耐盐性减弱，这与萝卜盐胁迫下RsAHP1表达模式类似[17]，说明RsAHP1可能对盐胁迫响应起正向调控作用。笔者还发现萝卜在热胁迫下，RsAHP5上调表达，RsAHP1和RsAHP2下调表达，说明热胁迫下RsAHP5可能对热耐性响应起正向调控作用，这与前人证实的“大多数热休克（HS）反应蛋白因细胞分裂素的增加而增加”这一结论相一致[35]。此外，在重金属胁迫下，萝卜RsAHP2在铬胁迫、铅胁迫和镉胁迫下均表现上调表达，表明RsAHP2可能在响应和抵御重金属胁迫方面具有正向调控作用。同时，非生物胁迫条件下，RsAHP3、RsAHP4和RsAHP6的表达无差异性变化，说明萝卜AHP家族基因可能在功能上存在冗余现象。萝卜AHP基因对不同非生物胁迫的不同响应，揭示了细胞分裂素信号因子与萝卜非生物胁迫应激反应之间的复杂相互作用，其具体的相互关系需进行更深入的试验论证。

笔者基于萝卜基因组、转录组数据和RT-qPCR分析结果，在全基因组水平上筛选鉴定萝卜AHP家族基因，进一步分析其氨基酸理化性质、作用元件、进化关系、发育与非生物胁迫下基因表达模式等。结果表明，鉴定到的6个萝卜AHP基因家族成员（RsAHP1～RsAHP6）中存在片段重复（RsAHP2/RsAHP5）和串联重复（RsAHP3/RsAHP4）基因对;系统进化分析表明萝卜、拟南芥和白菜的AHP家族具有很强的同源性和保守性;萝卜AHP基因启动子序列含有光响应、激素响应和防御应激与胁迫响应等多种顺式作用元件;萝卜AHP家族基因均在根中表达量高而在叶中表达量低，不同非生物胁迫条件下，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5表达差异显著，表明萝卜AHP基因家族与植物发育和响应非生物胁迫有密切关系。本研究结果为深入挖掘响应萝卜非生物胁迫的AHP基因及其作用机制研究提供了理论依据。

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