XTEN修饰延长多肽药物半衰期研究进展

于 爽，张 营，许祺珺，裴志花,2*，马红霞

(1.吉林农业大学 动物医学院，吉林 长春 130118；2.吉林省新兽药研发与创制重点实验室，吉林 长春 130118；3.吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林 长春 130118；4.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118)

随着生物学技术的快速发展，多肽药物已成为药物研发和临床治疗的热点。目前已上市或进入临床试验阶段的多肽药物已达数百种，涉及的病症也超过200种[1]。多肽药物具有生物活性高、低毒、低免疫原性、高组织渗透性和易于合成等优点，具有极为广泛的应用前景。然而，大多数多肽的相对分子质量较小，易被血液和肾脏快速清除，同时易被人和动物体内的多种蛋白酶和肽酶降解，因此大多数多肽类药物的体内半衰期较短，这严重限制了该类药物在临床上的应用[2]。为了解决多肽药物半衰期短的问题，近年来研究者利用DNA融合技术将多肽药物与其他蛋白融合、糖基化或与聚合物缀合等，增加了蛋白质的流体动力学体积或产生电荷效应，通过减小肾小球滤过率来延长多肽药物的半衰期，并取得了一定的成效[3]。在多肽药物与聚合物缀合来延长药物半衰期的研究中报道最多的是PEG化学修饰、PAS 缀合和XTEN修饰。XTEN修饰技术是近年来新兴的一种用于延长药物半衰期、增加药物稳定性的蛋白及多肽药物修饰技术，具有极为广阔的应用前景。现就XTEN蛋白修饰技术在延长多肽药物半衰期方面的研究做一总结，以期为多肽药物半衰期延长策略的研究提供理论依据。

1 XTEN蛋白修饰技术

1.1 XTEN蛋白序列XTEN是一条含有864个氨基酸的蛋白质聚合物，该聚合物及其不同长度的衍生物统称为XTEN。XTEN最初是Amunix公司[5]开发的一类非结构化的可生物降解的蛋白质聚合物，是一段由6个亲水、化学性质稳定的氨基酸组成的非重复性氨基酸序列。VOLKER等[4]尝试用以上6个氨基酸以不同比例组合成序列片段，在大肠杆菌中成功表达，并通过常规蛋白质色谱法纯化为具有确切长度和序列的单分散多肽[5]。XTEN具有亲水性高和免疫原性低的特点[6]，有较大的流体动力学体积且带负电荷，通过基因工程方法将多肽药物与XTEN融合，能够增强药物的稳定性和溶解性。非结构化XTEN多肽流体力学体积比类似质量的典型球状蛋白大得多，因此赋予与其连接的多肽药物以流体力学体积增大的效应，进而达到增强多肽药物的稳定性、溶解性及体内半衰期的目的。

1.2 XTEN序列的设计NATHAN等[5]发现了一个结构简单的多肽链可以形成类似于PEG的扩展构象，进一步研究发现非结构性蛋白序列XTEN能够提供体积增大效应，从而能稳定与之融合的蛋白质，并可能降低蛋白类药物的免疫原性。XTEN蛋白修饰不仅能够比聚乙二醇化修饰获得更均匀的最终产物，还能避免在修饰过程中发生化学偶联，而且可以精确地将修饰的多肽调整到任何期望长度，以控制血浆半衰期。

为了设计一种可溶的、化学稳定的、主要是非结构化的多肽，研究人员首先排除了疏水性氨基酸Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp和Tyr，因为它们易导致蛋白质聚集，且易引起HLA/MHL-Ⅱ介导的免疫应答。然后排除了带酰胺基团的氨基酸Asn和Gln，因为其化学性质不稳定、易水解。接下来又排除了带正电荷的氨基酸His、Lys和Arg，因为它们会与细胞膜相互作用。最后排除了易形成二硫键的氨基酸Cys。ALVAREZ等[7]曾尝试使用2～5个氨基酸的5肽重复序列来设计非结构氨基酸序列，结果显示出免疫原性和很低的溶解度，而血浆半衰期仅得到适度改善，这意味着需要额外的氨基酸来获得具有理想性质的蛋白聚合物。基于这些考虑，最终研究人员选择了Pro、Glu、Ser、Thr、Ala和Gly 等6种氨基酸，成功降低了免疫原性并增加了溶解度。研究人员[5-7]为了创建没有固定二级结构并能在大肠杆菌中稳定、高效表达的多肽，首先构建了1个包含以上6种氨基酸的36个非重复性的氨基酸片段库(每个片段包含8%A、12%E、18%G、17%P、28%S和17%T)，并从中筛选出约1 500个高效表达水平的独特片段。对这些高效表达的片段进行反复连接并重新筛选以获得最大表达，得到一个片段库，其中的每个片段包含864个氨基酸。然后对其中5个表达量最高的片段进行遗传稳定性、溶解度、热稳定性、抗聚集性和污染物分布(包括宿主细胞蛋白质、DNA和细菌脂多糖)等标准进行评估(数据未显示)，选择出了一个名为XTEN的序列，进行进一步研究发现其性质稳定，表达水平高。如今，该多肽及其不同长度的衍生物统称为XTEN[7]。

2 XTEN蛋白修饰技术的优势

2.1 多重机制延长多肽药物半衰期肾小球的滤过率与多肽药物的大小和电荷数有关。XTEN携带谷氨酸残基使融合蛋白带有大量负电荷，这会降低其与受体之间的亲和力，从而减少受体介导的蛋白药物的清除。另外，XTEN多肽携带大量负电荷，与基底膜之间发生静电排斥作用，也可以减慢肾小球的滤过作用，可进一步延长蛋白药物的血浆半衰期。并且XTEN是无规则卷曲构象的蛋白质，这使得多肽融合蛋白具有较大的流体动力学体积，从而减少肾小球对药物的滤过作用[8]，从而达到延长多肽药物半衰期的目的。

2.2 融合产物易于表达和纯化融合构建体的一个明显好处是便于表达、纯化和表征单个分子，该单个分子包括治疗药物部分和填充部分。为了适应遗传融合，有效载荷分子必须由蛋白源性L-氨基酸组成，并且融合产物必须是线性单向多肽[9]。由于XTEN蛋白聚合物经过工程改造，有非常高的溶解度，因此生成的融合产物可以方便地以可溶形式在胞质溶胶中表达。根据菌株的遗传因素和所使用的表达载体，可以利用T7/lac或phoA启动子系统来优化产物的表达[10]。XTEN融合产物通常显示出可增强所修饰目的肽和目的蛋白溶解度和热力学稳定性的特点[11]，有助于获得可溶性表达的目的蛋白和目的蛋白的纯化产物。

2.3 XTEN蛋白修饰有望取代PEG修饰聚乙二醇(PEG)是历史上第一种通常用于提高生物治疗剂体内半衰期的填充剂，现已被应用在多种已获批准的产品中[12-14]。PEG修饰有降低免疫原性、增加药物溶解性、减少蛋白酶降解、增加药物流体动力学体积等优点，但是仍存在纯化工艺复杂、成本高、长期给药时易产生抗PEG的抗体、会在肾脏中聚集等缺点。PEG不可生物降解，在动物研究中已观察到PEG化修饰化合物的细胞空泡[15-16]。尽管人们普遍认为PEG本身不具有免疫原性的，但据报道PEG化治疗剂的免疫原性似乎取决于被修饰蛋白质大小、PEG大小和化学组成。在用PEG化蛋白治疗的患者中检测到的抗PEG抗体的特异性和中和特性仍有争议，在健康人群中也有抗PEG抗体的报道[17]。PEG的成功和局限性都刺激了替代性可生物降解填充剂的开发(表1)。

与PEG修饰相比较，XTEN蛋白修饰技术具有以下几点优势:XTEN聚合物是在标准化技术平台中生产的，XTEN已经在该平台中表达并且优化后生产[18]，随后的XTEN纯化处理是高效且易于扩展的，产生了均匀的、高度纯化的本体[19]。XTEN蛋白聚合物具有较高的生物安全性，它能进行生物降解，不会在器官或细胞中蓄积，避免产生副作用；可以通过基因工程技术将XTEN和蛋白质进行融合表达，从而避免了体外化学偶联和修饰后的纯化、去除标签等步骤；融合蛋白的半衰期可通过调整多肽链的长度来调节，可以为临床用药提供选择，连接于蛋白药物的N端还是C端对于其生物活性的影响是可有可无的[20]；尽管XTEN具有大量的负电荷和体积，但对于不同大小和电荷的肽，接合反应通常进行得迅速而有效，这表明XTEN的物理化学特性不会导致聚合物上活性部分的屏蔽，也不会导致XTEN与目标肽之间产生非生产性的排斥或吸引作用[20]，且使用范围广[21]。除了PEG修饰外，还有其他延长半衰期的重组方法包括融合免疫球蛋白、抗体衍生片段、以及白蛋白或结合血浆中长寿命分子的结构域等技术，都有自己的优势，但是XTEN适用于更广泛的药物种类，原核和真核系统都可用于表达XTEN融合蛋白，因此XTEN修饰技术有望替代PEG修饰，在肽类和蛋白质类药物半衰期延长方面具有广阔的应用前景。

表1 XTEN蛋白融合与PEG修饰的比较

3 XTEN蛋白修饰技术在药物半衰期延长方面的应用

XTEN蛋白修饰技术可以通过融合表达和化学偶联2种方法来延长多肽药物的半衰期。化学偶联法需要分别生产XTEN和有效药物载荷、组分选择性交联以及最终结合物的纯化，这些额外的步骤较多而且麻烦。与化学偶联相比，XTEN融合蛋白通常易于表达，但仍需要对其表达和纯化步骤进行一些探索。利用基因融合产生XTEN蛋白的一个功能优势是能够将多个XTEN片段融合到感兴趣的治疗蛋白上，这一优势已提高和开发了几种药物的治疗能力[22]。在人生长激素(hGH)中，通过将XTEN的912个氨基酸残基序列融合到治疗蛋白的N端，使肾脏清除率最小化，而通过将XTEN的144个氨基酸残基序列融合到C末端，可以降低受体介导的清除率[23]。在凝血因子Ⅷ中，多个XTEN片段被整合到多肽药物的天然序列中[24]。XTEN蛋白聚合物由基因编码的氨基酸组成，因此可以重组融合到治疗性蛋白质或肽上[25]。目前，XTEN技术已应用在包括激素、凝血因子和多肽在内的多种生物治疗方法中。

3.1 XTEN与hGH融合肾脏过滤和受体介导的清除作用会清除人体内的生长激素，从而导致该药物在猴子中的半衰期为2～3 h[26-29]。VRS-317是一种新型的长效hGH-XTEN融合蛋白，正在临床研发中，用于治疗生长激素缺乏症(GHD)，经过专门设计的药物可包含这种双重清除抑制机制，从而延长药物在动物体内的半衰期[23](大鼠延长至15 h，猴子延长至110 h)。VRS-317的临床评估于2012年在50名GHD成人中开始。在这项单次递增剂量研究中，发现VRS-317是有效的，耐受性良好，没有意外或严重的不良事件，确定其半衰期为131 h，这表明VRS-317是潜在的按月剂量进行治疗的良好药物[30]。

3.2 XTEN与艾塞那肽融合艾塞那肽是一种39个氨基酸的肽，其作用类似于胰高血糖素样肽1(GLP-1)，目前以byetta的形式出售以治疗T2D(2型糖尿病)。由于其体积小且肾脏清除迅速，byetta的血浆半衰期为2.4 h，每天需用药2次。byetta治疗最常见的副作用是恶心、呕吐和腹泻[31]。2012年，byetta的缓释版本bydureon被FDA批准为首个每周1次用于治疗T2D的药物。然而，bydureon的注射部位结节发病率很高[32]。为了延长艾塞那肽的循环半衰期，将XTEN与该肽的C末端融合，融合分子被称为VRS-859[5]。VRS-859已在动物模型中进行了广泛测试，根据在小鼠、大鼠、猴和犬中确定的药代动力学参数，预计在人体内的半衰期为139 h[23]。

3.3 XTEN与胰高血糖素样肽2融合teduglutide在美国以gattex的名义出售，在欧洲以revestive的名义出售，是一种胰高血糖素样肽2(GLP2)类似物，适用于治疗患有节段性回肠炎疾病。与天然GLP2相比，teduglutide(GLP2-2G)在第2位具有甘氨酸取代基，增加了其半衰期和稳定性，从而将人的半衰期从7 min延长至3～5 h[33-35]。即使在循环半衰期有所增加的情况下，仍需每天服用teduglutide。这时长效GLP2-2G-XTEN有更高的疗效以及更少的给药频率。GLP2-2G-XTEN是通过GLP2-2G肽在其C端与864个氨基酸长XTEN遗传融合而产生的。在小鼠、大鼠和猴中，GLP2-2G-XTEN血浆半衰期分别显著延长至34，38,120 h。根据异速生长比例，估计在人体内的半衰期为240 h[16]。

3.4 XTEN与胰高血糖素融合低血糖症是糖尿病治疗中最常见的并发症，影响90%的糖尿病人群，严重低血糖症患者的死亡风险会增加[36-37]。Gcg是一种能够将肝糖原存储量转化为葡萄糖以释放到血液中的肽激素，通常在这种急性降血糖危机的情况下使用。由于其在液体制剂中的溶解性和稳定性差，目前市场上销售的Gcg为冻干粉，需要现用现配。天然Gcg的半衰期非常短，为8～18 min[38]，因此不适合在夜间低血糖症中预防使用[39-40]。由于XTEN蛋白聚合物能够改善多肽的溶解度、稳定性和半衰期，因此由XTEN修饰的Gcg可用于夜间低血糖预防性治疗。XTEN144-Gcg是通过将144个氨基酸长的XTEN重组融合到Gcg的C端而产生的。Gcg-XTEN144的溶解度比天然胰高血糖素高60倍，可以进行液体配制。在禁食的比格犬模型中，发现Gcg-XTEN144和天然Gcg均可引起血糖快速升高。但只有Gcg-XTEN144的作用持续了10～12 h，而Gcg的作用在2 h后恢复[6]。这些数据表明，Gcg-XTEN144有潜力成为预防夜间低血糖的有效药物疗法。

3.5 XTEN与凝血因子融合血友病a和b分别是由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)活性不足引起的遗传性出血性疾病。血友病的标准治疗方法是通过定期输注血浆来源的FⅧ/FⅨ或重组FⅧ/FⅨ来替代缺失的凝血因子，在血液中保持一定的凝结活性以防止出血[39-40]。此方案的临床结果显著改善，但由于这些凝血因子的半衰期短，导致了很高的治疗费用，因此需要延长其血浆半衰期。将FⅦ与288个氨基酸的XTEN的C端连接并表达出蛋白，通过常规色谱方法纯化[41-42]，评估血友病a小鼠单次静脉内输注后不同时间点的可溶性组织因子凝血酶原时间活性来确定药代动力学，还观察到终末半衰期显著延长(从1.2 h延长至8.9 h)[43]，以及在药代动力学曲线下的回收率和面积显著增加(表2)。

这些结果证明XTEN蛋白融合可以成功应用于复杂生物制剂，融合表达是一种可行的方式并显著延长多肽药物的半衰期以及改善药代动力学参数。

4 总结与展望

XTEN蛋白修饰结合了聚合物理想的物理化学性质和DNA编码蛋白质合成的精确性，其设计是专门用于模仿PEG的有益特性，同时避免了其某些缺点，例如具有免疫原性和缺乏生物降解性[47]。XTEN与多肽药物的融合导致其半衰期比原肽延长了60～130倍，此外还提高了其热稳定性和溶解性。但与所有延长药物半衰期的方法一样，XTEN蛋白修饰技术也具有一些缺点和不足，比如： XTEN及其修饰的多肽都必须由天然L-氨基酸组成，融合蛋白以线性单向多肽的形式产生，修饰后表达系统和纯化步骤等还有待探索和优化。然而，随着XTEN修饰技术研究的不断深入，这些缺点和不足必将得到克服。XTEN修饰已不限于XTEN蛋白与目的肽和蛋白质的末端融合，XTEN还可以在体外与其他类型的生物活性分子共价化学偶联，这样既可以将反应性基团放置在XTEN序列内的受控位置，也可以放置在其他附着位置。XTEN不仅可以作为一种可生物降解的填充剂，而且可以作为一个组装平台，将靶向部分和细胞毒性因子等多种功能结合到新的治疗方法中，用于更多的临床适应症。目前一些融合蛋白产物已进入临床试验阶段，如VRS-859、VRS-317等，随着研究的不断深入， XTEN蛋白修饰技术必将成为延长蛋白质和多肽药物半衰期不可或缺的有效手段，从而促进这类药物的临床应用。

表2 XTEN修饰多肽药物与原药的半衰期