PRRSV感染继发细菌性病原的致病性及耐药性分析

付霞丽，郑紫方，李 洋，肖书奇，李 爽

(西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的疾病[1]。其主要病理特征为妊娠母猪的繁殖障碍，表现为流产、死胎、木乃伊胎及仔猪呼吸道疾病[2]。该病毒可引起动物机体免疫抑制，一经感染常易继发细菌感染，如链球菌、副猪嗜血杆菌[3-4]，每年给养猪业带来巨大的经济损失，目前尚无确实有效手段预防该疾病的发生。

绿色气球菌(Aerococcusviridans)为革兰阳性菌，属链球菌科、气球菌属[5]。该菌在空气、土壤中广泛存在，人畜共患，为医院常见的条件致病菌，可引起关节炎、心内膜炎、菌血症、败血症[6]。该菌为革兰阳性球菌，极易与链球菌、金黄色葡萄球菌混淆。随着16S rRNA、基因组测序技术的应用和发展，越来越多的绿色气球菌被分离鉴定，逐渐引起人们的重视[7]。本研究从感染PRRSV后发病最严重猪的胸腔积液中分离出1株细菌，经形态学观察、生理生化试验、16S rRNA序列分析确定该菌为绿色气球菌，对其进行了药物敏感性分析，小鼠攻菌试验表明该菌具有致病性。本试验为动物疾病的诊断、预防和治疗提供技术支撑和实践指导，同时对深入研究绿色气球菌的致病机制奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 病料及实验动物攻毒PRRSV的仔猪胸腔中出现大量积液，无菌采取积液进行分离鉴定；5周龄清洁级BALB/c小鼠购自西安交通大学。

1.2 试验试剂革兰染液、氯化钠、营养琼脂、酵母提取物、蛋白胨购自上海沪鼎生物科技有限公司；细菌微量生化反应管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；药敏纸片购自杭州和微生物试剂有限公司；rTaq PCR Master Mix购自北京迪宁生物科技有限公司。

1.3 细菌分离培养无菌采集病死猪胸腔积液涂布于固体LB平板，37℃恒温培养箱中培养18～24 h,挑取单个菌落划线纯化培养。挑取纯化后菌落革兰染色、镜检，同时把单个菌落接种于液体LB培养基，扩大培养，用于后续试验。

1.4 生化试验将接有菌种的液体LB培养基置于37℃恒温摇床 (160 r/min) 培养24 h后接种于细菌微量生化反应管，于37℃恒温培养箱培养24～48 h 后观察结果。

1.5 药敏试验参照美国NCCLS药敏纸片扩散法进行:取分离菌纯培养物，涂布于普通琼脂平板上，贴上相应药敏纸片，37℃恒温箱培养18～24 h观察结果，根据抑菌圈直径(inhibitory zone diameter，IZD)大小来判定分离菌对药物的敏感性。

1.6 生长曲线测定试验取绿色气球菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入液体LB培养基，静止培养18 h作种子培养液。取盛有50 mL无菌液体LB培养基的250 mL三角瓶11个，分别编号为0.0，1.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，20.0 h。用无菌吸管分别吸取2 mL种子液加入已编号的11个三角瓶中，37℃振荡培养。分别按对应时间取出三角瓶，立即放在冰箱中贮存，待培养结束同一时间测定D450值。

1.7 动物致病性试验将20只成年小鼠随机分为4组：1组为对照组，2～4组为试验组。2～4组小鼠腹腔注射相同剂量(0.5 mL/只)不同浓度的菌液(1×108，1×107，1×106CFU/mL)，1组腹腔注射无菌生理盐水0.5 mL/只。试验组和对照组隔离饲养,记录观察小鼠的死亡情况。

1.8 16S rRNA鉴定设计16S rRNA通用引物，引物序列为：上游引物P1 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物 P2 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物由西安擎科生物技术有限公司合成。PCR扩增16S rRNA条带的大小为1 500 bp,PCR扩增体系为20 μL:rTaq酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL,双蒸水6 μL。PCR扩增条件:94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 50 s，共28个循环；72℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的条带的PCR产物送至西安擎科生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析,并应用MEGA 7.1软件对16S rRNA基因序列进行同源性分析及系统进化树的构建。

2 结果

2.1 发病猪的病变特征猪剖检前精神极度沉郁，不食，喜卧。剖检后病理结果显示，胸腔有大量淡黄色积液，脏器被覆一层伪膜，脾脏肿大，肝脏有出血性坏死点，淋巴结肿大，肺黏连，心包表面有纤维素性渗出物覆盖(图1)。

2.2 细菌分离培养分离菌株的生长特性和染色结果显示，37℃恒温培养24 h，在固体LB培养基可见白色、隆起，针尖大小菌落，血平板可见α溶血。革兰染色镜检，该菌为革兰阳性球菌，呈四联或两联(图2)。

图1 发病最严重的猪病理解剖图

A.分离菌株LB平板生长状态；B.分离菌株血平板生长状态；C.分离菌株100×油镜生长状态

2.3 细菌生化鉴定结果分离菌株生化鉴定结果显示葡萄糖、赖氨酸脱羧酶、麦芽糖、乳糖、蔗糖试验为阳性，阿拉伯糖、尿素、七叶苷、山梨醇、硫化氢试验为阴性(表1)。

2.4 细菌药敏试验采用药敏纸片法检测分离细菌对抗生素的敏感性，结果显示分离菌株对头孢他啶、头孢呋辛、头孢西啶、苯唑西林高度敏感，对万古霉素、青霉素G不敏感(表2)。

2.5 细菌生长曲线测定试验通过测定分离菌株不同时间的D值，描绘细菌的生长曲线，结果如图3所示，该分离菌在0～4 h为迟缓期、4～6 h为对数生长期、6 h以后为平台期(图3)。

2.6 细菌致病性试验1组小鼠注射0.5 mL无菌生理盐水，小鼠精神状态良好，持续观察未见小鼠死亡。2组注射1.0×108CFU/mL菌液小鼠精神极度萎靡，12 h之内小鼠全部死亡。3组小鼠注射1.0×107CFU/mL菌液，12 h后小鼠精神萎靡，12 ～24 h小鼠全部死亡。4组小鼠注射1.0×106CFU/mL菌液，24～36 h小鼠死亡3只，36～48 h小鼠死亡2只。剖检病死小鼠发现，小鼠肝脏、脾脏有出血点。从死亡小鼠心脏、脾脏、肺脏、肝脏均分离到菌株，经革兰染色镜检，菌体形态与分离菌株一致。16S rRNA扩增结果如图4所示，片段大小为1 500 bp，符合预期，胶回收后送测。

表1 细菌生化反应结果

表2 分离菌株药物敏感试验

图3 分离菌株生长曲线

2.7 细菌16S rRNA基因检测及序列分析将测定的分离菌株16S rRNA序列与NCBI 中各株绿色气球菌序列进行BLAST对比分析，结果同源性均在99%以上。选取10株气球菌属的16S rRNA 序列，利用MEGA 7.1 软件中Neighbor-jioning方法构建系统进化树，结果如图5所示，分离菌株SX-YL201903与KU92455.1、KU922464.1、KU922159.1、HQ425688.2同源性最高，表明分离菌株为绿色气球菌。

表3 分离菌株致病性试验 只

M.DL1000 DNA Marker;1～4.剖检小鼠16S rRNA扩增

3 讨论

绿色气球菌为链球菌科气球菌属的革兰阳性球菌，同一种属的还有尿道气球菌、柯气球菌、血气球菌、人尿气球菌，其中绿色气球菌为典型代表[8]。绿色气球菌在环境中广泛存在，为医院常见条件致病菌，常分离于感染的伤口、尿液、关节积液等[9-11]。后因滥用抗生素、养殖过程不规范等，绿色气球菌在病死龙虾、患有乳房炎牛的乳液中被分离鉴定[12-14]，在猪体内则鲜有报道。近些年来，随着基因测序技术发展，以及免疫抑制性疾病的存在，越来越多的绿色气球菌在猪体内被发现。MARTIN等[15]研究了58 株猪源绿色气球菌的生物学特性，提出该菌可能具有致病性。谢彬等[16]先后在广东和广西地区，从发病仔猪膝关节积液中分离到绿色气球菌。林华等[17]在广东地区从患病仔猪的心脏和肺脏中分离到绿色气球菌。张乃嘉等[18]在安徽省某猪场的发病仔猪心包积液中分离到绿色气球菌。LIU等[19]从奶牛体内分离到绿色气球菌，并建立小鼠模型进一步研究绿色气球菌的生物特性。绿色气球菌在动物医学领域逐渐引起人们关注。

图5 分离菌株与有关菌株的系统发育树分析

气球菌油镜下呈四联或两联，极易与链球菌或葡萄球菌混淆。本试验用16S rRNA通用引物提取细菌DNA进行扩增并测序，将测序结果与NCBI中的序列比对发现该菌与已知气球菌的同源性高达99%，因此从基因水平确定该菌为绿色气球菌。除此之外辅助于药敏试验、生化试验等，进一步确定该菌为绿色气球菌。

本试验从患病猪胸腔积液中分离到绿色气球菌，与之前报道的分离部位(关节积液、胸腔积液、肺脏、肝脏、脾脏)相符合。动物试验结果显示该菌有一定的致病力，能使小鼠死亡，说明该菌对靶动物的健康存在威胁。本株菌是在猪感染PRRSV的情况下分离到，且感染绿色气球菌猪的患病情况比单纯感染PRRSV的猪更加严重，说明继发绿色气球菌引起了猪更为严重的病理变化，加快猪死亡。

药敏试验结果显示该分离菌株对头孢他啶、头孢呋辛、头孢西啶、苯唑西林高度敏感，对万古霉素、青霉素G不敏感，这一结果与其他地区分离到的绿色气球菌的药敏结果不完全一致。这是因为不同地方在养殖过程中所使用的抗生素不同，导致猪对抗生素的敏感性不尽相同，这一结果为有效治疗绿色气球菌感染提供了可靠的参考依据。绿色气球菌为条件致病菌，在动物机体免疫力低下，或饲养条件恶劣的情况下都易导致该菌的侵袭，因此良好的饲养管理对于该疾病的预防至关重要。

本研究从感染PRRSV的猪体内分离到致病菌，为继发性细菌感染的研究提供基础材料，同时为生产实践中该病的预防和治疗提供理论依据。