UPLC-MS/MS法检测中药制剂中的27种非法添加化药成分

辜 慧， 杜 钢， 李澍才， 张媛媛

(四川省食品检验研究院， 四川 成都 611731)

0 引 言

中药以副作用小、疗效确切、成本低廉等优点，在我国几千年历史中被广泛应用于各类疾病的防治。与传统药物相同，中药同样需要采用可靠的手段来证明其安全性和有效性，中药虽然起效慢，但其疗效缓和，可以到达标本兼治的效果，因此有些中药常被大众服用以改善体质[1]。一些不法商家利用中药制剂成分复杂、现有分析方法无法对各成分均进行全面检测的特点，向中药中非法添加化药成分，以加快中药疗效，从而增加药品销量。在患者不知情的情况下，若持续服用含有非法添加化药成分的中药制剂，会产生不可预知的不良反应，严重危害生命安全[2]。非法添加药物种类繁多，液质联用技术因具有检测范围广、选择性高、准确、快速等特点[3-9]，在多种化合物同时检测中具有较强的优势。本文从减肥药、壮阳药、降糖药、解热镇痛药中选定易被添加的27种化药成分作为检测对象，采用液相色谱-串联质谱法进行测定。该方法前处理简单、快速、具有稳定可靠的定量分析能力、高分辨率及更低的检出限，以期为中药制剂非法添加的检验工作提供技术支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1290-G6460 QQQ三重四极杆质谱仪（美国安捷伦公司），ME204天平（十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司）；FB15065超声波发生器（美国Fisher公司）；Milli-Q型高纯水发生器（美国Millipore公司）。

1.2 试剂

西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、酚酞、咖啡因、芬氟拉明（批号：S042714，美国 A ChemTek Inc，100 µg/mL）；双醋酚丁（批号：7-RJH-182-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS，97%）；西地那非、羟基豪莫西地那非、他达那非、氨基他达拉非、伐地那非、伪伐地那非（批号：S037021，美国 A ChemTek Inc，100 µg/mL）；硫代西地那非（批号：B0002255，BePure，99.8%）；2-羟基丙基去甲他达那非（批号：1-HPA-25-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS，98%）；育亨宾（批号：520024-201401，中国食品药品检定研究院，99.3%）；贝诺酯（批号：100225-201704，中国食品药品检定研究院，99.9%）；对乙酰氨基酚（批号：100018-201610，中国食品药品检定研究院，99.9%）；氨基比林（批号：100503-201803，中国食品药品检定研究院，99.7%）、地塞米松（批号：100129-201907，中国食品药品检定研究院，99.8%）；醋酸地塞米松（批号：100122-201707，中国食品药品检定研究院，99.2%）；吡罗昔康（批号：100177-201704，中国食品药品检定研究院，99.5%）；二甲双胍、苯乙双胍（批号：C0007483，BePure，10 µg/mL）；格列本脲、格列美脲、吡格列酮（批号：C0007484，BePure，10 µg/mL）。

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，德国CNW公司)。分析用水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm，1.8 µm），进样体积：1 µL，柱温：35 ℃，流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，流量为0.5 mL/min，梯度洗脱，程序见表 1。

表1 梯度洗脱程序表

2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式（ESI+），多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描，电离电压：3.0 kV；干燥气流量：9 L/min；干燥气温度：325 ℃；鞘气流量：9 L/min；鞘气温度：350 ℃；雾化器流量：40 psi（1psi=6.895 kPa）。具体质谱参数见表 2。

表2 27种化药成分定性、定量离子和质谱分析参数

2.3 溶液的配制

2.3.1 标准溶液

精密称取上述固体对照品适量，用甲醇溶解并定量稀释制成质量浓度为1.0 mg/mL的单个标准储备液。再分别精密量取各标准储备液适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释，配制成1 µg/mL混合标准工作溶液，使用前用甲醇逐步稀释至浓度分别为10，20，50，100，150，200 ng/mL 的混合标准系列溶液。

2.3.2 供试品溶液

片剂、散剂、丸剂及颗粒剂，取10份研细混匀；胶囊剂，取10粒内容物研细混匀；液体制剂，取10份混匀。精密称取样品1 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液（必要时可将续滤液进行适当的稀释）。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

取浓度为100 ng/mL混合标准溶液及不含任何化学药阴性样品溶液，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件进样测定，分别得到对照品及阴性样品总离子流图，经提取MRM色谱图，阴性样品色谱图中均无干扰目标物测定的色谱峰。结果表明该方法专属性强。27种化药成分正模式下MRM总离子流图如图1所示。

图1 27种化药成分总离子流图

2.4.2 线性范围考察

取“2.3.1”项下浓度为10，20，50，100，150，200 ng/mL 的混合标准系列溶液，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件进样测定，以27种化学药的定量监测离子对色谱峰峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果表明27种化药成分在10～ 200 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.992，结果见表3。

2.4.3 检测限和定量限试验

向不含任何化学成分的中药制剂中加入混合标准工作溶液，经稀释后进样，以信噪比为3时计算各成分的检测限，以信噪比为10时计算各组分的定量限。结果检测限（LOD）在 0.0061～0.3750 µg/g，定量限（LOQ）在 0.0204～1.2500 µg/g，见表 3。表明该方法具有较高的灵敏度，能够满足27种化药成分的检测要求。

表3 27种化药成分的线性方程、相关系数、检测限及定量限

2.4.4 进样精密度考察

取“2.3.1”项下浓度为 100 ng·mL–1的混合标准溶液，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件连续进样6次，在MRM模式下计算提取定量离子峰面积的RSD为0.1%～ 6.0%（n=6），表明仪器的进样精密度良好。

2.4.5 重复性考察

取一批阳性（检出贝诺酯）样品，按“2.3.2”项下方法进行样品前处理，平行制备6份样品，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件检测，计算得样品中贝诺酯平均含量为40.02 µg/g，RSD为5.8% (n=6)，表明方法重复性良好。

2.4.6 加标回收率试验

以经检测不含非法添加化药成分的空白样品为基质，采用 3个浓度 (1.0，2.0，5.0 µg·g–1)添加混合标准工作溶液（质量浓度为 1 µg/mL），按“2.3.2”项下方法进行样品前处理，每个添加浓度平行操作6次，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件检测，计算回收率和RSD，结果见表4。27种化药成分的平均回收率在80.4%～ 120.9%之间，RSD为0.8%～ 7.8%。

表4 27种化药成分的平均回收率和相对标准偏差（n=6）

2.4.7 溶液稳定性考察

取“2.4.5”项下回收试验溶液（含量为 1.0 µg/g），在制备后分别室温放置 0、2、4、8、12、16、24 h，按“2.1”和“2.2”项下的色谱条件和质谱条件检测，在MRM模式下计算提取定量离子峰面积的RSD为1.5%～ 6.9%，结果表明溶液在24 h内稳定。

2.5 样品测定

采用上述方法对50批次日常监督抽检中药制剂进行检测分析，结果均未检出27种非法添加化药成分。对10批次委托样品进行检测分析，结果一批鼻炎颗粒检出地塞米松（3.82 µg/g）和醋酸地塞米松（619.71 µg/g）、一批私人诊所配制中药制剂检出贝诺酯（40.02 µg/g）、两批中药制剂检出西地那非（49768.89 µg/g、84247.39 µg/g）。

3 讨 论

3.1 样品前处理方法的考察

检测非法添加物检验标准方法及文献中多数采用100%甲醇超声提取[10-17]，且甲醇对本文中27种化药成分的溶解性均良好，故采用甲醇超声提取的方法。经过比较超声时间，确定了前处理条件为超声10 min。一般情况下，非法添加剂量比较高，因此在实际测定样品过程中，为避免进样浓度过高导致仪器污染，宜根据样品实际含量，提取后再进行适当的稀释后进样。

3.2 色谱条件及质谱条件的优化

本试验采用正离子模式，在水相中加入0.1%甲酸，可以增加离子化的效率，增加各化合物的响应值。同时比较了甲醇和乙腈作为有机相的分析效果，结果表明乙腈能够更好分离27种化药成分，同时能够降低柱压，保护色谱柱。所以采用流动相0.1%甲酸-乙腈系统，进行梯度洗脱。

将27种非法添加药物的混合标准溶液（100 ng·mL–1），在正离子模式下，直接进样，确定各化合物母离子参数。确定母离子后，用子离子扫描方式选取丰度较高的2个子离子分别作为定量和定性离子，在相应模式下优化毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数。色谱峰按出峰时间进行采集，最大程度增加了提取离子的扫描时间，使MRM灵敏度和重现性增强。

4 结束语

本文建立了UPLC-MS/MS法同时检测减肥类、壮阳类、降糖类、解热镇痛类中药制剂中易被添加的27种化药成分，该方法灵敏度高、前处理简单且回收率良好，可用于日常检测，为打击不法商家、维护良好的中药制剂市场提供强有力的技术支撑，对保证消费者用药安全具有较强的现实意义。