柠檬醛对小鼠生长性能、肌内脂肪含量及脂肪酸代谢酶的影响

陈静，尤瑞国，刘慧敏，杨国庆

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

如何提高畜禽肉质性状是当今全世界畜牧业的热点和难点。肉色、嫩度、风味、多汁性和系水力是肉质的重要指标，它们都与肌肉内的脂肪(intramuscular fat,IMF)含量有密切的关系[1-2]。IMF含量丰富是高品质肉质的重要特征，提高IMF的沉积量，从而提高肉的品质，对于增强中国畜牧业的竞争力及相关产业的持续发展具有重要的实际意义。IMF分为肌内脂肪和肌间脂肪[3]，二者的功能与特点相似但又存在区别，但对于改善肉品质均有重要作用。提高IMF含量有遗传学、营养、肠道微生物等多种方法，而利用营养学的方法增加畜禽的IMF含量是一种快速有效、简便易行的手段。天然饲料添加剂如沙棘叶黄酮[4]、甜菜碱[5]、谷氨酰胺[6]等已经在生产中得到应用，动物的生产性能、肉品质等显著提高。

柠檬醛是一种有机物，属于开链单萜分子。天然柠檬醛是顺式柠檬醛和反式柠檬醛的混合物[7]，在山苍子油中含量丰富，容易获得且价格低廉，在自然状态下性质稳定。柠檬醛具有浓郁香味，多用于食品调香剂和保鲜剂，具有抗真菌、抗氧化作用[8-10]。另外，柠檬醛还可用于动物的饲料添加剂，主要发挥风味剂[11]和防霉脱毒作用[12]，提高动物食欲和抑制黄曲霉菌等致病菌的产毒能力。饲料中添加柠檬醛，可以影响牛、羊、鱼等生长性能、消化酶含量、产奶量和蛋白含量等相关指标[13-15]，而柠檬醛在调控IMF沉积中的作用很少涉及。因此，为了探索柠檬醛对畜禽IMF沉积的影响，本试验以小鼠为试验对象，通过饲料添加的方法，研究柠檬醛对小鼠生长性能、IMF沉积及其相关基因表达水平、脂肪酸代谢酶水平的影响，为其在畜牧生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用柠檬醛(顺式+反式)，CAS:5392-40-5，规格：100 mL，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其外观无色流动液体，流散性好；纯度≥97%。

1.2 试验设计及饲料

将40只5周龄体重(20±2)g的雄性昆明小白鼠(购于河南省实验动物中心)随机分为试验组和对照组2组，每组20只，5只一笼。首先进行7 d的动物房环境适应，然后进行18 d的饲喂试验。在饲喂试验中，对照组饲喂基础饲料，试验组在基础饲料中添加3.5%柠檬醛。试验饲料执行标准参照国家标准《实验动物配合饲料营养成分》(GB 14924.3—2010)配置。

1.3 动物饲养管理

每只小鼠进行剪趾标记。笼舍、用具和场地在试验前进行彻底消毒，保持卫生，湿度适宜，温度控制在20～25 ℃，光暗周期12/12(光照时间为08:00—20:00)，每天定时饲喂，每2 d更换垫料，自由采食，乳头式饮水器自由饮水，防疫和消毒均按规定程序进行。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能 每3 d逐只称量小鼠空腹体重并记录，详细记录每天采食量，计算平均日增重、平均日采食量。

1.4.2 样品采集与IMF含量测定 饲喂结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，取股四头肌用生理盐水清洗后装入10 mL冻存管，迅速浸入液氮中，保存在-80 ℃的超低温冰箱，用于后续试验。采用脂肪测定仪(海能SOX406)根据食品安全国家标准《食品中脂肪的测定》(GB 5009.6—2016)检测股四头肌IMF含量。

1.4.3 股四头肌中PPAR(α、γ)、A-FABP的表达水平测定 取肌肉组织样品，加1 mL放射免疫分析RIPA蛋白裂解液，使用分散机(IKA公司T10basic ULTRA-TURRAX)研磨，冰上孵育30 min，12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，95 ℃煮沸10 min，采用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天)法测定蛋白浓度。蛋白裂解液样品经12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)100 V电泳，100 V、90 min转硝酸纤维素(NC)膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，置于4 ℃、20 r·min-1水平摇床，使用一抗PPAR(α、γ)、A-FABP及内参β-actin(CST)进行免疫印迹反应，室温孵育二抗2 h，ECL-star显影液覆盖NC膜，使用化学发光成像系统曝光显影，Image J软件分析蛋白相对表达量。

1.4.4 脂肪酸代谢限速酶的表达水平测定 取肌肉组织样品，分散机研磨，使用RNAi Plus试剂盒(TaKaRa)按说明书提取总RNA，核酸定量仪检测RNA的浓度，1%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测RNA完整性。使用TaKaRa反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。引物参考NCBI中GenBank公布的基因序列，使用Primer5.0软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，使用莫纳荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR反应。PCR反应条件：预变性(95 ℃ 30 s)；扩增(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s)，40个循环；溶解(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 60 ℃ 5 s)，反应体系为SYBR Green qPCR Mix，10 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)，0.4 μL；cDNA，50 ng，补DEPC水至终体积20 μL。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primers sequences of fluorescence-based quantitative real-time PCR

1.5 统计学分析

使用Graphpad Prism 6.0软件对数据进行t测验分析，结果用平均值±标准误(Means±SD)表示，P>0.05 表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 柠檬醛对小鼠生长性能的影响

经过7 d的动物房环境适应后，对小鼠进行18 d的饲喂试验。从适应期开始记录小鼠每天的采食量，每3 d对所有小鼠分别称重。结果表明(表2)，试验组小鼠的平均日增重显著提高；试验组小鼠的平均日采食量也有提高但差异不显著(P>0.05)，试验组小鼠的生长速率显著高于对照组(图1)。

表2 柠檬醛对小鼠生长性能和采食量的影响Table 2 Effects of citral on growth performance of mice

图1 小鼠体重变化Fig.1 Weight changes of mice

2.2 柠檬醛对小鼠IMF含量的影响

饲喂实验结束后采集所有小鼠的股四头肌组织，索氏提取法测定脂肪含量后发现，与对照组相比，试验组小鼠股四头肌IMF含量显著提高，即柠檬醛诱导小鼠脂肪沉积增加(图2)。

图2 股四头肌IMF含量检测结果 Fig.2 IMF content in quadriceps femoris

2.3 柠檬醛对PPAR(α、γ)、A-FABP表达水平的影响

提取小鼠股四头肌组织RNA(图3A)和总蛋白，以RNA反转录得到的cDNA为模板，荧光定量PCR检测PPARα、PPARγ和A-FABP基因的转录水平。结果表明，与对照组相比，试验组小鼠股四头肌PPARα、PPARγ、A-FABP的mRNA表达水平均显著升高(P<0.05或0.01)(图3B)；Western bloting方法检测PPARα、PPARγ、A-FABP的蛋白表达水平，并对信号条带进行灰度分析，结果表明，PPARα、PPARγ和A-FABP蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)(图3C和D)。

A:股四头肌组织总RNA电泳，1-6泳道为不同小鼠股四头肌组织RNA。B:试验组与对照组小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)基因mRNA相对表达量。C:Western blot检测小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)蛋白的表达，(M:1、2为试验组小鼠；3、4为对照组小鼠)。D:试验组与对照组小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)蛋白灰度分析结果。

以2.3反转录得到的cDNA为模板，以脂肪酸代谢酶基因引物进行QPCR扩增分析。结果表明(图4)，与对照组相比，试验组小鼠股四头肌脂肪酸分解代谢酶基因CPT-1、ACOX1、AMPK的mRNA相对表达量均显著下降(P<0.05)，ACOX3、CD36的相对表达量无显著差异(P>0.05)。

图4 脂肪酸分解代谢关键酶基因mRNA相对表达量Fig.4 Relative mRNA expression of key enzyme genes in fatty acid metabolism

2.5 柠檬醛对脂肪酸合成代谢酶表达的影响

同样以2.4的方式，对小鼠脂肪酸合成代谢酶基因进行QPCR分析发现(图5),与对照组相比，试验组小鼠股四头肌FASN、ACC的mRNA相对表达量显著上升(P<0.05)，DGAT1、LACS的表达量差异不显著(P>0.05)；脂肪酸代谢酶基因的熔解曲线见图6。

图5 脂肪酸合成代谢酶基因mRNA相对表达量Fig.5 Relative mRNA expression of enzyme genes in fatty acid synthesis

A：从左至右依次为LACS、ACC、FASN熔解曲线；B：DGAT1、CPT-1、CD36；C：AMPK、ACOX(1、3)；D：β-actin。A：From left to right are the melting curves of LACS，ACC，FASN; B:DGAT1，CPT-1，CD36; C:AMPK，ACOX(1，3);D: β-actin.

3 讨论与结论

以往对柠檬醛性质的研究多见于抗菌、驱蚊、驱(杀)虫、抗氧化、保鲜、抗癌等方面，对动物生长性能的影响见于牛、羊和鱼等。本研究发现，柠檬醛的饲料添加促进了小鼠的生长速度，与上述动物试验的结果相符，说明柠檬醛有较为广泛的促生长作用。

柠檬醛的饲料添加对动物IMF含量的影响研究未见报道，本试验发现柠檬醛可显著提高小鼠的IMF含量；在调控IMF的分子机制研究上，作者还检测了A-FABP、PPARs基因，发现其表达水平均有显著的提高，支持IMF含量升高的结果。刘志成等[16]、刘瑞莉等[17]、张军等[18]在猪、牛、鸭等动物试验中均发现A-FABP、PPARs基因与IMF含量呈显著相关性。CHEN等[19]研究表明，IMF含量随莱芜黑猪的生长不断增加且H-FABP和A-FABP基因的表达也随之增强，但只有A-FABP的mRNA水平与IMF的含量存在着显著的函数关系。PPARs基因己被公认在调控脂肪细胞分化中起重要作用。DUVAL等[20]研究发现，PPARα在肌肉组织中的高表达加速了线粒体中脂肪酸的氧化速率；PPARα同时调控脂肪酸转运蛋白基因(FATP)、脂肪酸转位基因(FAT/CD36)的表达，增加细胞质从血液中吸收脂肪酸的速率。LI等[21]研究表明，脂肪细胞的PPARγ基因的敲除导致小鼠进行性脂肪营养不良。本试验结果显示，与对照组相比，柠檬醛可显著提高IMF含量和PPARα、PPARγ基因的表达，参与脂肪氧化相关的PPARα表达量显著升高，可能的原因是PPARα不仅具有增加细胞吸收脂肪酸的功能，还是参与调控脂肪沉积的重要中间因子，如影响A-FABP、FATP的表达与活性等。试验组A-FABP的表达水平显著增加，提示促进A-FABP等基因的表达是提高肉品质的方法之一。本试验对小鼠的研究结果说明，柠檬醛可以提高动物的IMF沉积，但是在畜禽中能否达到相同的结果还需要进一步的试验来验证，同时有必要着重研究PPARα、PPARγ、A-FABP等表达水平的升高对畜禽IMF的影响，从分子水平探索提高IMF的新思路。

IMF沉积还受到脂肪酸代谢的影响，IMF含量取决于脂肪酸的合成、分解、转运及沉积等，机体通过协调控制脂肪代谢酶的活性和基因表达来调节脂肪沉积。研究表明，FASN是肌肉组织脂肪酸再生能力的主要限速酶。陈杰等[22]通过测定肥育期苏太猪背长肌相关基因的表达水平发现，FASN与HSL的mRNA比值与IMF含量之间存在显著的正相关；ACC是脂肪酸合成的重要限速步骤,关系到甘油三酯(TG)的底物浓度[23]。本研究中柠檬醛提高了FASN和ACC基因的表达水平，促进了小鼠的脂质合成。CPT-1是参与脂肪酸β氧化的限速酶，负责将长链脂肪酸转运进入线粒体；ACOX特异性地催化长链脂肪酸β氧化，在鼠、猪、和鱼等物种中与脂肪酸代谢和脂肪沉积密切相关[24-25]。本试验中CPT-1、ACOX表达量的降低表明柠檬醛显著降低肌肉细胞线粒体中脂肪酸的β氧化速率，将其转化脂肪储存；AMPK可通过磷酸化ACC抑制其活性，研究显示小鼠骨骼肌中的AMPK缺失会导致严重的脂肪沉积和胰岛素抵抗[26]。本试验结果显示，与对照组相比，试验组小鼠脂肪酸合成代谢酶FASN、ACC的表达显著上升而分解代谢酶CPT-1、ACOX1、AMPK显著下降，提示IMF沉积的增加。

本试验结果表明，在小鼠日粮中添加3.5%的柠檬醛可显著提高小鼠生长性能、IMF含量及相关调控基因和脂肪酸合成代谢酶的表达水平，同时显著降低脂肪酸分解代谢酶的表达水平，说明柠檬醛具有促进生长并提高动物肉质的潜力。