连续4年施用生物炭对土壤细菌多样性及其群落结构的影响

殷全玉， 李想， 王典， 张明月， 王兆双， 云菲， 王新发， 刘国顺

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州，450002；2.河南省烟草公司许昌市公司，河南 许昌 461099；3.许昌市烟草公司襄城县分公司，许昌 襄县 452670；4.河南惠农土质保育研发有限公司，河南 登封 452470)

过去的几十年间，以氮素为主的无机肥料被大量施用到耕地上用来提高作物产量[1]，但是氮肥的过量施用并不总是能增加作物产量，甚至还会导致低的养分利用效率，土壤质量下降和环境恶化[2]。发展集约化农业的重大挑战是维持土地生产力和阻止土壤退化[3]。目前好的解决措施是在减少化肥施用的同时投入一定量的有机物料来减轻化肥的负面影响，同时增加作物产量和土壤养分[4]。有机物料虽然可以提高土壤养分，但其长期效应大多较差，这是因为大多数的有机化合物会被矿化，只有少量低活性的物质会留存在土壤中[5]。生物炭是生物质资源在高温贫氧条件下热解制成的富碳产物，和传统的木炭不同，生物炭的环境定位是专门应用于土壤的生态调理剂[6]。由于可以促进环境碳固存，还可以提高作物产量和减少肥料的使用，因此生物炭被认为是应对全球环境挑战的“双赢”方案[7]。生物炭中的碳以惰性碳为主，不易被微生物降解，可以在土壤中稳定存在数百年[8]。

土壤微生物在养分循环转化、生物防治、碳库稳定和团聚体的形成等方面发挥重要作用[9]。越来越多的研究表明，较高的微生物多样性可以增强生态系统和微生物功能的稳定性[10-11]。生物炭疏松多孔的结构可为微生物的生长提供温床，其中丰富的碳源、生长因子和矿质营养有利于土壤微生物的生物量的增加[12]。细菌繁殖周期短，速度快，数量最多，能够快速分解进入土壤的物质，是土壤生物学性状最佳反映者[13]。目前，国内外学者做了大量关于生物炭施用后对土壤细菌群落结构影响的研究，HAN等[14]研究发现，连续多年施用生物炭改变了棉田土壤细菌群落结构，同时改变了土壤中接近半数细菌种类的相对丰度，这可能有助于改善棉田连作下土壤微生物多样性降低的问题。ZHANG等[15]指出生物炭的施入使土壤微生物的生物量和活性增加，并且在长期施用条件下微生物群落结构会不断得到改善。IMPARATO等[16]研究发现不同剂量生物炭的施入对土壤细菌群落的功能和结构多样性都存在一定的影响，但这种影响持续时间非常短。本研究从连续4年施用生物炭的田间改良试验中收集了土壤样品，主要为了探明生物炭长期施用对土壤理化性质的影响、研究生物炭长期施用对土壤微生物的影响以及土壤细菌群落结构与土壤环境因子的相关性。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

本试验于2015—2018年在河南农业大学许昌校区现代烟草农业科教园区进行，地理坐标为34°16′12″N，112°42′31″E，海拔(72.8±9.8) m，属暖温带季风型气候，年平均气温14.3 ℃，平均降水量640.9 mm，平均相对湿度为83%，无霜期217 d，日照时间2 104.4 h。土壤类型为褐土，质地属于砂壤土，基础肥力见表1。供试生物炭由河南惠农土质保育研发有限公司提供；在350 ℃条件下连续炭化加工制成的花生壳生物炭，具体理化性质如表2所示。供试烟草品种为K 326。

表2 供试生物炭理化性质Table 2 Physical and chemical properties of biochar tested

1.2 试验设计

试验共设置4个处理：不施生物炭和化肥的休耕处理(FL)；施用化肥(CK)；化肥+1.5 t·hm-2生物炭(B1.5)；化肥+15 t·hm-2生物炭(B15)。采用随机区组试验设计，每个处理设置5次重复。试验用到的化肥分别是硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸钾，每个施肥处理的氮素用量是30 kg·hm-2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶3，根据当地施肥习惯，70%的化肥于整地后移栽前条施，30%的化肥于移栽时穴施。每年3月中旬将生物炭撒施入土壤中，然后用旋耕机将生物炭与0～20 cm耕作层搅拌混合。种植体系为一年一茬，4月下旬起垄条施化肥，5月初移栽，试验持续4 a。试验周围设置保护行，除生物炭用量外其他试验因素和管理措施均保持一致。

于2018 年8月中旬在每个试验小区采用5点取样法取采集土壤样品。每个处理采集5个重复混合样，共计20个样品。首先将新鲜土样过2 mm筛网去除作物残体和碎石杂块，而后分为3个部分：一部分直接测定土壤含水率；一部分装入无菌离心管，用冰盒带回实验室，置于-80 ℃冰箱内保存，用于提取土壤DNA和后续的生物信息学分析；另一份样品在室内晾干、过筛、分装，用于土壤其他各种常规理化特性的测定。

土壤各种速效养分、pH值、含水率、容重的测量依据常规标准方法进行，总碳和总氮采用碳氮元素分析仪(Vario MAX CN，Elementar，德国)测定，有机碳采用TOC 分析仪(Vario TOC，Elementar，德国)测定，土壤团聚体采用干筛法和湿筛法分别测定了≥5 mm，2～5 mm，1～2 mm，0.5～1 mm，0.25～0.5 mm 和<0.25 mm等不同粒级的团聚体组成。并在此基础上计算了>0.25 mm机械稳定性团聚体(DR0.25)含量，水稳定性团聚体(WR0.25)含量和团聚体平均质量直径(MWD，mm)。

1.4 土壤细菌群落结构的测定

1.4.1 土壤总DNA提取及PCR扩增 利用E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒(OMEGA公司，美国)提取土壤样品的基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000(Thermo Scientific 公司，美国)分光光度仪检测提取的DNA含量和纯度，检测合格后，采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌总DNA的V4区进行扩增，PCR 反应体系30 μL：Phusion Master Mix(2×)，15 μL，引物(2 μmol·L-1)，3 μL，模板DNA(1 ng·μL-1)，10 μL ，H2O，2 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；30 个循环包括(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s)；72 ℃延伸10 min。

1.4.2 建库测序及序列处理 PCR扩增产物纯化后，将所有重复样品等比例混合，利用北京诺禾致源科技有限公司Illumina-MiSeq测序平台完成测序，并对原始下机序列进行质控。采用 USEARCH (version 7.1)软件将所有序列进行操作分类单元(OTU)的划分与聚类，在每组OTU中选择丰度最高的序列作为该组OTU 的代表序列。所有代表序列采用 RDP Classifier 分别从门和属水平上进行物种注释(分类阈值>0.8)[17]。

1.5 数据处理与统计分析

采用Mothur 软件分别计算样本 Shannon 指数、Chao1 指数及测序覆盖度[18]。土壤理化指标，细菌群落 alpha多样性及不同分类水平上物种相对丰度的差异采用SPSS 软件Duncan’s多重比较进行单因素方差分析(P<0.05)。采用 SPSS 软件分析环境因子与菌群相对丰度的Pearson相关系数。样本间群落组成差异采用主成分分析(PCA)非度量多维尺度排序分析(NMDS)。环境因子对样本间细菌群落结构差异的影响采用冗余排序分析(RDA)。PCA、NMDS和RDA的可视化采用R软件(version 3.3.1)的“vegan”包绘图。

2 结果与分析

2.1 生物炭对土壤理化性质的影响

由表3可知，与只施化肥相比，施用生物炭显著提高了土壤pH值、含水率、有机质、碳氮比(P<0.05)。土壤容重随着生物炭用量的增加而显著降低(P<0.05)。随着生物炭用量的增加，土壤速效钾先显著升高(P<0.05)后降低。与只施化肥相比，施用生物炭处理的MWD显著高于对照(P<0.05)，B1.5处理的DR0.25和WR0.25均显著高于其他处理，B15处理的DR0.25和WR0.25与CK间无显著性差异。相较于休耕处理，单施化肥与施用化肥+生物炭均可以显著提升土壤含水率、容重、有机质和团聚体指标(P<0.05)，对于pH值、碳氮比和速效钾的影响不大。

表3 生物炭对土壤理化性质的影响

土壤pH值和碳氮比呈显著正相关(r=0.84，P<0.01)，均与土壤容重呈显著负相关(r=-0.85，P<0.01；r=-0.79，P<0.01)(表4)，这与4种不同施肥制度下的土壤容重差异一致。土壤含水率与MWD及DR0.25呈显著正相关(r=0.78，P<0.01；r=0.7，P<0.01)，与WR0.25之间没有显著相关性，含水率和团聚体指标(MWD、WR0.25和DR0.25)在4种施肥制度下表现出不同的模式，这与生物炭的施用有关。土壤有机质与含水率和团聚体指标(MWD、DR0.25和WR0.25)呈显著正相关(P<0.05)。土壤速效钾与WR0.25呈显著正相关(r=0.6，P<0.01)。

表4 土壤理化特性间的Pearson相关性分析结果Table 4 Pearson correlation analysis results of soil physical and chemical properties

测序样本经聚类划分为5 050个OTU，归类于46个门，52个纲，114个目，201个科，429个属。所有样本共得到1 398 630条有效序列，单样本平均序列数为69 932条。按照97%的序列相似度对序列聚类，获得的样本平均OTU数目为4 063，B1.5处理OTU数目显著高于其余处理(P<0.05)。Chao1 指数和Shannon 指数常用来评价细菌群落alpha多样性。B1.5和B15处理的Chao1指数显著高于FL和CK处理，B15处理的Shannon 指数显著高于其余处理(P<0.05)。样品测序覆盖度为97.74%～98.86%，可以较好地反映样品序列的真实情况，满足后续的一系列分析(表5)。

表5 基于V4区的细菌群落测序数据和alpha多样性Table 5 Based on bacterial community sequencing data and alpha diversity in V4 region

2.3 生物炭对土壤细菌群落结构的影响

2.3.1 生物炭对土壤细菌门水平上物种相对丰度的影响 物种注释结果表明，各样本中门水平上细菌菌群主要归类为6个菌门：变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，这些优势菌门在所有可注释菌所占的比例分别为27.98%、21.73%、13.21%、11.4%、6.76%和6.13%，相对丰度总和占可注释菌的比例为87.21%(图1)。

图1 所有样本中细菌门水平上的物种相对丰度

不同优势菌门细菌相对丰度在4种不同的施肥方式间存在差异。变形菌门在FL处理中相对丰度较低，在CK处理中相对丰度较高，土壤中施用化肥和生物炭对变形菌门的相对丰度无明显影响。施肥处理的酸杆菌门相对丰度显著低于休耕处理(P<0.05)，只施化肥和化肥+生物炭处理的酸杆菌门差别不大。放线菌门和芽单胞菌门在施肥处理的相对丰度显著低于FL处理(P<0.05)。拟杆菌门在CK和B1.5处理中相对丰度较高，B15处理和FL处理中较低。绿弯菌门在B15处理的相对丰度最高，在CK处理相对最低，FL和B1.5处理的相对丰度显著高于CK(P<0.05)(图2)。

注：误差线为标准误差，误差线上的的不同字母表示不同处理之间的显著性差异(P<0.05)。Note: The error line is the standard error, and the different letters on the error line indicate the significant difference between different treatments (P<0.05).图2 不同处理组门水平上优势细菌相对丰度Fig.2 Relative abundance of dominant bacteria at phylum level in different treatment groups

2.3.2 生物炭对土壤细菌属水平上物种相对丰度的影响 土壤细菌属水平上的物种注释结果显示，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在不同处理的相对丰度最高，在4个处理的平均丰度为2.91%～5.28%(表6)。相对丰度大于1%的菌属为细菌菌群里的优势菌属。不同处理土壤中unidentified_Acidobacteria、芽孢杆菌属(Bacillus)、Dongia的相对丰度差异不大。FL处理的优势菌属相对丰度整体高于施肥处理。与CK相比，生物炭的施用对土壤中马赛菌属(Massilia)、 Bryobacter和Haliangium的相对丰度影响不大。随着生物炭施用量的增加，黄杆菌属(Flavisolibacter)和溶杆菌属(Lysobacter)的相对丰度均表现出先增加后减少的趋势。此外，节杆菌属(Arthrobacter)的相对丰度在生物炭施用量为15 t·hm-2时显著增加(P<0.05)。

表6 不同处理属水平上优势细菌相对丰度

2.3.3 细菌群落相似性排序分析 为比较不同处理间土壤细菌群落结构的差异，采用基于Weighted Unifrac 距离的主成分分析(PCA)和非度量多维尺度分析(NMDS)来解释土壤细菌群落的beta多样性(图3)。PCA排序分析表明，施肥处理和休耕处理的土壤样品细菌组成存在显著差异，CK和B1.5处理的样本点分布重合度较高，B15处理的样本点分布和态势与CK较为接近，表明随着氮肥或生物炭向土壤中的添加，细菌群落呈现出显著的变化，在施用化肥的基础上添加少量生物炭(1.5 t·hm-2)，细菌群落未发生明显的变化，施加大量的生物炭(15 t·hm-2)则会使细菌群落结构向休耕土壤的方向发展。NMDS排序分析也获得了相似的结果。

图3 基于Weighted Unifrac距离的土壤细菌群落结构分析

2.3.4 土壤细菌群落结构与环境因子的相关性 由图4可知，RDA分析的前两个排序轴的解释率分别为74.74%和19.16%，所选的9个环境因子一共解释了93.9%的排序特征值，对土壤细菌多样性变化具有显著影响。其中每个处理的样本点相对地聚集在一起，FL和B15处理子样本点相对组间距离较近，主要分布在RDA1负半轴方向上，CK和B1.5处理子样本点分布的离散性更大，在RDA1正半轴方向上分布(图4)。此外，Mantel 检验结果表明，细菌群落结构与土壤环境因子密切相关，其中DR0.25(r=0.610 1，P=0.004)、MWD(r=0.554 1，P=0.003)、AK(r=0.532 7，P=0.0351)、WR0.25(r=0.463 8，P=0.031 4)和SBD(r= 0.443 2，P=0.006)对细菌群落结构影响最大(表7)。

注：pH：pH值；C/N：碳氮比；SBD：容重；WC：含水率；MWD：平均质量直径；WR0.25：水稳定性团聚体；DR0.25：机械稳定性团聚体；OM：有机质；AK：速效钾。

表7 细菌群落组成与土壤环境因子之间相关性的Mantel检验

细菌优势属和土壤理化性质的相关分析显示，溶杆菌属(Lysobacter)与C/N显著负相关(P<0.05)。Haliangium与SBD、WR0.25和DR0.25显著负相关(P<0.05)。黄杆菌属(Flavisolibacter)与C/N显著正相关(P<0.05)，与含水率和平均重量直径MWD显著负相关(P<0.05)。Dongia与WR0.25显著负相关(P<0.05)。节杆菌属(Arthrobacter)与pH显著正相关(P<0.05)，与SBD显著负相关(P<0.05)。unidentified_Acidobacteria与WR0.25显著正相关(P<0.05)。鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)与SBD、含水率、WR0.25、DR0.25和有机质均显著负相关(P<0.05)(表8)。

表8 细菌优势属相对丰度与土壤理化指标的相关性Table 8 Correlation between relative abundance of dominant bacterial genera and soil physical and chemical indexes

3 结论与讨论

生物炭通过与土壤颗粒发生复杂的物理化学变化而实现对土壤养分的长期影响[19]，主要表现在土壤pH值、含水率、孔隙度和阳离子交换量(CEC)的改善与土壤肥力的提升[20-21]。生物炭的添加可以增加土壤总碳，并且对碳库的固持能力可以维持3年以上[22]。考虑到生物炭自身的含氮量极低，因此生物炭对土壤中有效氮的影响可以忽略不计。这里观察到生物炭对土壤碳氮比的增强效应主要是通过增加含碳量实现的。尽管生物炭中的惰性碳在其碳库固持量占了较大比重，但是在这一过程中微生物量碳也有增加[22]。本研究中生物炭的添加增加了土壤pH，这可能是生物炭大多呈碱性，且灰分含量较高，可以有效地降低土壤交换性H+含量[23]。土壤团聚体的特殊形态和层次结构是存储和维持有机质的良好载体[24]。大型团聚体是由土壤的富碳有机物形成的，大型团聚体塑造的过程也诱导形成了微型团聚体[25]。添加生物炭是增加有机质的有效方式，微生物的降解会消耗有机物，生物炭的稳定结构可以在一定程度上扭转土壤有机质的退化[3,26]。加入生物炭的土壤含有较多数量的稳定团聚体，包括机械稳定性团聚体(DR)和水稳定性团聚体(WR)，这可能是原生质体和细胞壁物质会在生物炭的生产过程被彻底分解，增加了营养物质的供给[27]。生物炭施入土壤后可以降低土壤容重，增强土壤孔隙通透性并改善微生态环境，这是由于生物炭是有低密度的颗粒物组成的[28]。

土壤微生态环境与微生物的生长关系密切，土壤水分，孔隙度和养分状况都会对土壤细菌群落造成影响。生物炭能够通过改变土壤的物理化学特性，从而影响土壤微生物群落结构和功能[34]。本研究发现各级土壤团聚体指标是影响细菌群落结构的重要环境因子，有研究发现，土壤含碳量的增加可以促进细菌多样性，同时各级团聚体数量和比例均有明显增加[35]，这和本研究的结果有相似之处。本研究发现生物炭对部分土壤细菌相对丰度的影响并未随生物炭用量的增加而加强，说明生物炭影响细菌群落的生态过程较为复杂，还需更进一步研究。

综上所述，生物炭添加到土壤中4年后改善了土壤理化特性，显著提高了土壤含水率、有机质含量和碳氮比，有效地增强土壤团聚体稳定性。施用生物炭4 a后增加了土壤细菌丰富度，细菌群落结构明显改变。土壤容重、速效钾和团聚体指标是细菌群落结构变异的主导性因子。生物炭对于提升植烟土壤养分有效性和改良微生态具有明显的效果。但是还需要深入研究生物炭对不同类型土壤生物学特性的影响，以期为生物炭的生态改良提供参考。