荞麦蜜提取液对西方蜜蜂存活及Vg和Sir2基因表达量的影响

宋文菲, 卢焕仙, 黄新球, 荀利杰, 余玉生, 李亚辉, 王艳辉

(1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所, 云南 蒙自 661101;2.云南农业大学动物科学技术学院, 云南 昆明 650201)

西方蜜蜂Apismellifera是中国的一种重要传粉昆虫，在农业生产中具有不可替代的经济价值和生态价值。在人类可利用的1 330种作物中，约有1 100多种需要蜜蜂进行授粉[1]。蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜后酿造的一种天然糖类物质，主要成分包括单糖类(果糖和葡萄糖)和水[2]，蜂蜜在维持蜂群的繁育、行为学和级型分化中发挥了极其重要的作用[3]。荞麦蜜是中国重要的单花蜜之一，研究发现，荞麦蜜的蛋白质、矿物质和酚类物质明显高于其它大宗单花蜂蜜[4-5]，荞麦蜜多酚粗提物和各级份在化学体系和细胞抗氧化体系具有一定的清除作用，在人类保健中具有较高的营养价值[6]。在蜜蜂饲养中，为了促进蜂群繁育，会对蜂群进行补充饲喂和奖励饲喂，从而保证蜂巢内有充足的饲料储备，以及调动工蜂的哺育能力和采集能力，通常采用蜂蜜与50%蔗糖水进行饲喂[7-8]。除食物对蜂群繁育有直接影响外，蜜蜂体内的寿命基因也对其生长发育和寿命起到一定的调控作用。工蜂寿命调节与保守的卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因有关，蜜蜂的Vg基因在蜂王和长寿工蜂中维持了较高的水平[9]；Vg主要在蜜蜂的胸部和头部脂肪体细胞中表达，老龄蜂王的Vg基因水平比工蜂高[10]。沉默信息调节子2(Silent information regulator 2, Sir2)蛋白是一类存在于古生菌到哺乳动物中高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶。研究发现寿命基因Sir2在蜂王的表达水平显著高于工蜂，表明Sir2基因是类蜂王基因，是影响蜜蜂寿命的重要基因之一[11]。另外，Sir2基因从限制热量的代谢方面调节细胞的衰老进程[12-13]。基于荞麦蜜提取液在细胞抗氧化体系中具有一定的清除作用，目前尚无荞麦蜜提取物质对蜜蜂存活及寿命基因的研究报道。本研究采用荞麦蜜的4种提取液饲喂西方蜜蜂，分析提取液对成年工蜂的存活率，以及对Vg和Sir2寿命基因相对表达量的影响，旨在为蜜蜂饲养中筛选利于蜂群繁育的饲喂物质，探讨荞麦蜜提取液与工蜂Vg和Sir2基因的相互关系，为蜜蜂的饲养和繁育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 化学试剂 Trizol提取液、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RT-qPCR反转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq II(均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，DEPC水(购自北京索莱宝有限公司)。

1.1.2 主要仪器 NanoDrop 2000型分光光度计(Thermo Scientific)、StepOnePlusTM型qPCR仪(Applied Biosystems公司)、梯度PCR仪(Applied Biosystems公司)、低温高速离心机(德国 Sigma公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、HWS智能型恒温恒湿箱(宁波江南仪器厂)。

1.2 荞麦蜜提取液的制备

采用本实验室建立的方法制备荞麦蜜提取液，具体步骤为：称取300 g荞麦蜜于500 mL烧杯中，加入100 mL蒸馏水，混匀后转入1 000 mL分液漏斗中，加入100 g石油醚，充分混匀后静置分层，取上层液于50 mL离心管中，5 000 r·min-1离心10 min，取上层液于500 mL蒸馏烧瓶中，下层液转入分液漏斗中，分别用100 mL石油醚重复提取2次，合并上层液于蒸馏烧瓶中，40 ℃下在旋转蒸发仪上浓缩至干，加入10 mL蒸馏水在蒸馏烧瓶中，超声混匀后40 ℃浓缩至干备用。下层液加入100 mL乙酸乙酯，重复提取3次，上层有机相合并于另一500 mL蒸馏烧瓶中，40 ℃下在旋转蒸发仪上浓缩至干，加入10 mL蒸馏水在蒸馏烧瓶中，超声混匀后40 ℃浓缩至干备用。重复此步骤，逐步加入正丁醇、乙腈，得到荞麦蜜正丁醇、乙腈提取物。将4种提取物(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈)用30 g 50%的蔗糖水分3次移到塑料瓶中，超声助溶，加入50%的蔗糖水至250 g，分别得到荞麦蜜的4种提取液。

1.3 荞麦蜜提取液对不同日龄成年工蜂存活率的影响

试虫采自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所饲养的西方蜜蜂蜂群。把刚出房的1日龄成年幼蜂放入饲养盒(26 cm×18 cm×9 cm)，饲养盒置于恒温恒湿培养箱(温度27 ℃，相对湿度62%，黑暗条件)。将1.2中制备好的荞麦蜜提取液分别放入饲料盒中供成年幼蜂自由取食，从2019-08-07开始饲养，以400只成年幼蜂作为1个处理，重复3次，于2019-08-16(10日龄)进行成年工蜂死亡数的统计，每隔5 d统计1次，至2019-09-09结束，统计不同日龄成年工蜂的存活率。

1.4 荞麦蜜提取液对不同日龄成年工蜂Vg和Sir2基因相对表达量的影响

1.4.1 总RNA提取及反转录 从1.3各提取液中选取不同日龄(16、27、34日龄)活体成年工蜂，采用50%糖水饲喂100头1日龄成年幼蜂，取16、27、34日龄活体成年工蜂作为对照样本(CK)，用液氮冻毙，各处理均以3只成年工蜂头部为1个生物学样本，设置3个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA，取1 μL RNA测定其浓度及OD值(A260/A280)，要求OD值在1.8～2.1之间，采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，获得的cDNA 在-20 ℃保存备用。

1.4.2 引物设计及合成 采用Primer 5.0设计引物，由上海生工生物公司合成，引物信息见表1。

1.4.3 qPCR荧光试验 qPCR荧光反应总体系为20 μL：TB Green Premix Ex Taq II：10 μL；PCR primer(F+R)(10 μmol·L-1)：1.6 μL；ROX Reference Dye(50倍)：0.4 μL；cDNA：2 μL；dH2O(灭菌蒸馏水)：6 μL。反应程序为95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，57 ℃，1 min(40个循环)；添加溶解曲线。设置3个水平重复孔。荧光验证时选择Gapdh作为内参基因，计算ΔCt(测试样本)=Ct(目标)-Ct(内参)，ΔCt(对照样本)=Ct(目标)-Ct(内参)，ΔCt=ΔCt(测试样本)-ΔCt(对照样本)，相对表达量=2-ΔCt。

1.5 数据分析

采用SPSS17.0软件中单因素方差分析，LSD多重比较，分析不同处理、不同日龄成年工蜂之间基因相对表达量差异。

2 结果与分析

2.1 荞麦蜜提取液对不同日龄成年工蜂存活率的影响

从图1可看出，随着日龄增加成年工蜂的存活率呈逐渐下降的趋势，荞麦蜜不同提取液对其存活率存在一定差异。0号(石油醚提取液)饲喂的成年工蜂各日龄存活率最低，至35日龄存活率仅为31.46%。其他3种荞麦蜜提取液(1～3号)饲喂的成年工蜂存活率在10～25日龄期间基本一致，其存活率均在77.44%以上，25日龄后存活率急剧下降，以2号(正丁醇提取液)饲喂的成年工蜂存活率最高，至35日龄存活率仍维持在56.27%，1号和3号提取液在35日龄时存活率分别为38.84%和32.71%。这表明荞麦蜜正丁醇提取液对成年工蜂的存活率最为有利，在10～25日龄采取荞麦蜜正丁醇提取液进行饲喂，可维持成年工蜂较高的存活率，有利于蜂群繁育。

注：0号：荞麦蜜石油醚提取液；1号：荞麦蜜乙酸乙酯提取液；2号：荞麦蜜正丁醇提取液；3号：荞麦蜜乙腈提取液。

2.2 荞麦蜜提取液对不同日龄成年工蜂Vg基因相对表达量的影响

从图2可看出，16日龄时，1～3号荞麦蜜提取液饲喂成年工蜂后其体内Vg相对表达量较CK相比均显著下调(P<0.05)。27日龄时，1～3号试验组的Vg相对表达量均显著上调(P<0.05)。其中，3号(乙腈提取液)的Vg相对表达量最高，是CK的2.81倍，与其余3个试验组达到极显著差异(P<0.01)。至34日龄时，1～3号试验组的Vg基因相对表达量下调，其中1、2号试验组与CK达到极显著差异(P<0.01)。这表明随着日龄的增加，1～3号试验组成年工蜂体内Vg基因相对表达量呈现先上升后下降的趋势。

注：1号：荞麦蜜乙酸乙酯提取液；2号:荞麦蜜正丁醇提取液；3号:荞麦蜜乙腈提取液；CK为50%糖水。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

由图3可看出，16日龄时，1～3号荞麦蜜提取液饲喂成年工蜂后其体内Sir2相对表达量较CK相比均极显著上调(P<0.01)。其中，3号(乙腈提取液)的Sir2相对表达量最高，与CK相比上升了2.03倍，极显著高于其他3个试验组(P<0.01)。27日龄时，1～3号试验组的Sir2相对表达量均下调，其中 3号(乙腈提取液)的Sir2相对表达量最低，是CK的0.24倍，显著低于其他3个组(P<0.05)。至34日龄时，与CK相比，1～3号试验组都极显著下调(P<0.01)。表明随着日龄的增加，1～3号试验组成年工蜂体内Sir2基因相对表达量呈现逐渐下降的趋势。

3 结论与讨论

由于在蜜蜂养殖中人类对蜂巢内蜂蜜定期采集，在蜜源匮乏季节易出现食物短缺问题，对蜜蜂的繁育、抵抗力等造成不利影响[1,3]。蜂蜜是维持蜜蜂生长发育的基本的物质之一，蜜蜂养殖中常采用蜂蜜与50%蔗糖水混合后作为蜂群的营养补充[7-8]。本研究表明，3种荞麦蜜提取液(乙酸乙酯、正丁醇、乙腈)饲喂的成年工蜂在10～25日龄期间维持了较高的存活率。说明随着荞麦蜜提取过程的深入，3、4级提取液(正丁醇、乙腈)对10～25日龄成年工蜂的存活率高于1、2级提取液(石油醚、乙酸乙酯)。推测可能与荞麦蜜中含有抗氧化活性的成分，其粗提物在细胞抗氧化体系具有一定的清除作用有关[6]，但荞麦蜜提取液如何参与蜜蜂抵御外界不良环境影响还需要进一步研究。荞麦蜜不同提取液饲喂的成年工蜂在25日龄后存活率急剧下降，表明成年工蜂进入衰老期，食物对其存活率的调控作用较小，但35日龄时荞麦蜜正丁醇提取液饲喂的成年工蜂存活率仍维持在56.27%，建议在成年工蜂10～25日龄采取荞麦蜜正丁醇提取液进行饲喂，可维持成年工蜂较高的存活率，有利于蜂群繁育。

图3 荞麦蜜提取液对不同日龄成年工蜂Sir2相对表达量的影响

不同级型蜜蜂的生长发育和寿命除受到营养物质、内分泌调节外，还与其体内的基因调控有密切关系[14]。本研究表明，3种荞麦蜜提取液在成年工蜂16～27日龄时，与CK相比Vg相对表达量均显著上调(P<0.05)，至34日龄时，Vg相对表达量均下降，呈现出先上升后下降的趋势。研究发现，蜜蜂体内的保幼激素(Juvenile hormone, JH)升高会抑制卵黄形成，导致Vg滴度降低[10]，JH滴度在成年工蜂2～3周(哺育蜂)内较低，在采集蜂中的JH滴度较高，而血淋巴中的Vg水平与JH滴度正好相反[15-16]。表明成年工蜂体内的Vg相对表达量可能受到蜜蜂行为发育中JH滴度水平的影响。3种荞麦蜜提取液在16～34日龄时，与CK相比Sir2相对表达量均处于下调状态，这与Sir2在酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇中通过热量限制模式对生物体寿命发挥调控作用[17]的结果不一致。Sir2p是促进酿酒酵母寿命的限制性成分，增加基因拷贝数可以延长野生型细胞的寿命[18]；秀丽隐杆线虫Sir-2.1通过下调胰岛素信号通路发挥延长寿命的作用[19]，推测可能与Sir2在不同物种间的调控机理差异所致。