奶牛乳房炎关联微生物群落结构及多样性检测

张皓淳

(辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110034)

奶牛的乳房一旦出现病症，会直接影响牛奶品质。一般来说，奶牛乳房炎多由机械性刺激、病原微生物侵入以及化学、物理性损伤引发，因此通过高通量测序技术进行检测，分析关联微生物群落结构及多样性，有助于从分子学角度确定诱因，从而“对症下药”。1 材料和方法

1.1 仪器设备的选用

运用高通量测序技术检查奶牛乳房炎关联微生物群落结构及多样性，选用的设备如下：美国Sigma公司生产的Sigma3-18K离心机、美国Labnet公司生产的Labnet 230VEU涡旋仪、美国ABI公司生产的ABI 7200 PCR仪、美国Thermo公司生产的Nanodrop ND1000分光光度计、北京TIANGEN公司生产的PCR Master Mix、德国Qiangen公司生产的QIAquick Gel Extraction Kit。

1.2 检测方法及流程

1.2.1 样品采集及预处理。为了使测试结果具备对照效果和足够的说服力，从某奶牛牧场选取了患有乳房炎的奶牛，对其乳头进行擦拭，获取样品。同时对该奶牛所产牛奶也进行样本收集。首先，在进行样本擦拭收集时，需要考虑样本中微生物的活性，因此使用无菌棉签，蘸少量具备灭菌功能的生理盐水，对奶牛的乳头进行擦拭，获得样本后密封入无菌存储管中；其次，对奶牛乳头进行清洁处理后，挤出牛奶，同样密封入无菌存储管中。为了保证实验的客观性，共收集患病奶牛奶头擦拭样本9个，其序号分别为HB1～HB9，由患病奶牛所产牛奶样本5个，编号为HBN1～HBN5；同时收集未患病且身体健康的奶牛奶头擦拭样本两个，序号为ZC1～ZC2；正常牛奶样本两份，序号为ZCN1～ZCN2。为了保持样本中微生物活性及其他成分不会发生变化，从牧场到实验室的过程中，所有样本均存放在-80℃的冰箱内。

1.2.2 提取DNA以及16S rRNA基因扩增及高通量测序之后，对测序结果进行分析，将模糊及“断断续续”的序列清除出分析序列，根据序列总长进行统计，删除的长度大约为500 bp。使用Mothur Version 1.39.1软件包中的Miseq SOP程序开展分析,经过去除Chimera后对序列进行分类信息分析,Threshold参数为80,数据库的序列和分类信息来源为SILVA SSURef database v128。

1.2.3 通过对可造作分类单元及发育系统数据进行分析，结合序列相似度为97%的情况对OTUs进行分析，经过对每个OTU序列数目的统计之后，可以将序列比例超过10%的OTU分别存放，用于后续的比对分析。之后在其他OTU中选择序列，通过Blast比对方式，完成其与NCBI中GenBank数据库的比对工作。

1.2.4 挑选出只具备1条序列的OTU，计算其覆盖度，应用的公式为C=[1-(n1/N)]×100。其中n1指代序列数量，即OTU序列只有1条；N代表序列的总数。经过与数据库中序列的对比后，需要计算全体序列之间的差异，得出Cutoff值为0.03。将输出的距离矩阵文件使用Cluster命令进行聚类,继而使用rarefaction.single命令分别计算各个样品的OTU数目、Chao1和ACE指数。此后，使用Thetayc算法对所有样品的序列计算距离矩阵和聚类,并进行聚类分析[2]。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳房炎微生物群落样品测序结果及多样性指数

根据16S rRNA基因序列测序标准，对样品中的微生物群落构成及其多样性进行分析，为了保证客观性，滤除并冗余处理样本中原始序列条带中质量较低的部分，经过处理后得到的患乳房炎奶牛奶头与正常奶牛奶头擦拭样本序列数及多样性指数如表1所示。患乳房炎奶牛奶头挤出的牛奶样本与正常牛奶样本的序列数及多样性指数如表2所示。根据表中数据分析可得出如下结论：第一，无论奶牛患病与否，奶头擦拭样本中的OTU数目及微生物的多样性均远远超过牛奶样本中的对应数量。第二，患乳房炎奶牛奶头擦拭样本中OTU数目和微生物多样性比正常奶牛奶头擦拭样本中对应数量高。第三，患乳房炎奶牛所产牛奶样本中OTU数目和微生物多样性比正常奶牛所产牛奶样本低[3]。

表1 患乳房炎奶牛奶头与正常高产奶牛奶头擦拭样本序列信息及多样性指数

表2 患乳房炎奶牛所产牛奶与正常高产奶牛牛奶样本序列信息及多样性指数

2.2 微生物群落多样性分析

使用QIIME软件对样本中的水平上菌群组成进行分析，共显示出10种细菌类群。乳头擦拭样本与牛奶样本中，占据分布优势的细菌类群比例有所差异。特点如下：在乳房擦拭样本中占据分布优势的细菌群，按照数量排布次序分别为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门，这四种细菌类群在所有样本中均有体现，但各自占比不尽相同。经过详细比对可知，在HB1样本中梭杆菌门含量最高，占比率达47%；变形菌门在所有牛奶样本中占比最高，处于2、3位的分别是厚壁菌门和放线菌门。而在HB9样本中，含量最高的细菌类群为厚壁菌门和变形菌门。总体来看，变形菌门的含量最高。如表3所示，为11个奶头擦拭样本中分列前两位的细菌类群及占比量。如表4所示，为7个牛奶样本中分列前两位的细菌类群及占比量。

表3 11个奶头擦拭样本中分列前两位的细菌类群及占比量

表4 7个牛奶样本中分列前两位的细菌类群及占比量

2.3 基于最终结果的讨论分析

根据上述分析可知，奶牛乳房表面含有的微生物与牛奶中的微生物无论是种类还是数量均有较大差距。通过对其他文献资料研究分析可知，牛奶中的微生物构成符合奶牛乳房整体的细菌群落分布。奶牛一旦患有乳房炎，其内外微生物组成均会发生显著改变，而内、外源病原菌均会诱发疾病。

3 结语

将高通量测序技术应用于奶牛乳房炎检测，通过观察其微生物群落结构，探索其共处方式和规律，明确其获取营养成分及代谢类型，同时结合其多样性及在不同“位置”的分布情况，有助于判断该病的诱因，不仅可以制定针对性的治疗方案，还能为后续的防治工作提供准确的依据[1]。通过高通量测序技术对奶牛乳房炎关联微生物群落结构及多样性进行分析，将来自不同“位置”的样本进行对比，能够清楚看到其内微生物的分布情况，从而根据客观事实做出精确判断。通过结果对比可以发现，此种方式精确、客观，准确性较高，能够对引发疾病病原菌的源头进行追溯，不仅能够制定针对性治疗方案，还能够探知其影响范围，从而为后续预防工作提供参考。