基于网络药理学和分子对接技术研究藏药短穗兔耳草治疗慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎的作用机制

单佳铃，朱继孝，熊浩仲

(1. 南昌大学第一附属医院药学部，2. 江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西 南昌 330004)

急性痛风性关节炎(acute gout arthritis，AGA)是由于体内嘌呤代谢增加，尿酸产生过多或排泄不良而导致血中尿酸水平升高，尿酸盐结晶沉积在关节囊、关节滑膜或其他组织中而引起的炎性疾病[1]；酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是一类由于长期性饮酒导致的慢性进行性肝脏疾病，疾病的初期表现为酒精性指肪肝，之后逐渐发展为酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化等，严重酗酒甚至会引起肝细胞坏死导致肝功能衰竭，从而引起一系列的并发症[2]。

短穗兔耳草(LagotisbrachystachysMaxim)，藏药名“直打洒曾”，为玄参科植物短穗兔耳草的干燥全草，主要分布于甘肃、四川、青海和西藏等地。《晶珠本草》等记载短穗兔耳草味苦、平，能清肺胃瘀血、排脓，治疗肺痈咳逆、胸满吐脓血等症,具有清热去火、消炎解毒的功效[3]。目前从短穗兔耳草中分离的化合物主要包括黄酮类、环烯醚萜苷类、苯乙醇类、苯丙素苷类等[4-6]，现代药理研究表明短穗兔耳草具有抗菌、抗各种类型肝损伤(四氯化碳、ANIT、酒精性肝损伤)、抗高尿酸血症等[7-10]。

“网络药理学”是由英国药理学家Hopkins提出，是在系统生物学和生物信息学的基础上从网络平衡的角度来认识药物与机体间的关系，这种多层次研究策略与复方中药的整体观原则相一致，为传统中药或复方中药药效物质基础及作用机制研究提供了新的手段。中药具有“多成分多靶点多途径”的协同作用特点，传统的药理学很难全面系统地阐述其作用机制与分子基础，而网络药理学作为一种新的研究方法已成为揭示中药或中药复方治疗疾病的分子机制的一种新途径，且目前备受中医药研究者的关注。分子对接是通过受体与药物分子之间的相互作用来预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。本文采用网络药理学结合分子对接技术对短穗兔耳草治疗痛风性关节炎和慢性酒精性肝损伤的分子机制进行研究，筛选并获得短穗兔耳草治疗两种疾病的有效活性成分及作用靶点，为其后续研究提供参考。

1 方法

1.1 短穗兔耳草有效化学成分通过整理课题组前期分离所得化合物[4]及查阅国内外文献[5-6]得到短穗兔耳草中的化学成分55个。在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)中通过化合物名称或CAS号搜寻得到化合物信息，设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18筛选出符合条件的化合物作为有效化合物。

1.2 有效化学成分靶点的预测将获得的有效化合物输入TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、PharmMapper Server(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、CTD(http://ctdbase.org/)、SwissTargetPrediction(http://new.swisstargetprediction.ch/?)数据库，获得短穗兔耳草有效化合物可能作用的靶点。通过UniPrpt数据库(https://www.uniprot.org/)校正其蛋白名称为官方名称，并限定物种来源为人。

1.3 疾病靶点的预测以“Chronic alcoholic liver Disease” “Acute gout arthritis”作为检索词，通过Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)检索得到两种疾病的相关作用靶点。通过UniPrpt数据库(https://www.uniprot.org/)校正其蛋白名称为官方名称，并限定物种来源为人。将上述有效成分的相关靶点与疾病的相关靶点取交集，获得短穗兔耳草治疗慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎的共同作用靶点，以便进行后续分析。

1.4 有效成分-疾病-共有靶点网络及共有靶蛋白互作(PPI)网络的构建将获得的有效成分、疾病、共有靶点信息导入Cytoscape3.7.2绘制有效成分-疾病-共有靶点网络图。同时，为明确共有靶点间相互作用的关系，将筛选得到的共有靶点导入String11.0(https://string-db.org/)构建共有靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein proteininteraction，PPI)模型。将蛋白种类设置为人种进行操作，将最低作用阈值设置为0.400，其他参数则保留默认设置。将PPI网络模型导入Cytoscape3.7.2软件，运用“Network Analysis”功能进行分析,并依据节点度(degree)和中介中心度(betweenness centrality)评价两种疾病的共有靶点，确定可能的关键靶蛋白。将获得的关键靶点依次导入DisGeNET数据库，获取靶点对应的类型。

1.5 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析将共有靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.7(https://david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp)，选择生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞学组分(cellular component，CC)进行基因本体(gene ontology，GO)分析；选择KEGG进行靶点基因通路注释分析，以P<0.05进行筛选，分析短穗兔耳草治疗ALD和AGA的主要信号通路。

1.6 “成分-靶点”分子对接本研究选取疾病共有靶点拓扑分析中节点度排名前4的靶点蛋白INS、IL6、ALB、TNF作为对接蛋白与筛选所得的7个潜在活性成分的化合物分别进行对接，验证其相互作用活性。在PBD(http://www.rcsb.org/)数据库中下载靶点蛋白3D结构的PDB文件，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载化合物2D结构的sdf格式。将准备好的靶点蛋白和化合物导入discovery studio 2016中，利用Libdock模块进行分子对接。结合能小于0说明受体和配体能够自发结合，本研究参考文献[11]选取结合能≤-5.0 kcal·mol-1作为其相互作用活性筛选的依据。

2 结果

2.1 短穗兔耳草有效化合物的获取根据1.1中的方法筛选得到有效化合物7个，各个化合物及其OB和DL值见Tab 1。

Tab 1 Effective compounds of Lagotisbrachystachys Maxim

2.2 作用靶点的预测结果通过PharmMapper Server、CTD、SwissTargetPrediction数据库预测得到的化合物相关靶点去除重复靶点后得到靶点5 027个。通过向Gene Cards、OMIM、TTD数据库输入“Chronic alcoholic liver Disease”关键词获得ALD疾病相关作用靶点去除重复靶点后得到靶点4 212个；通过向Gene Cards、OMIM、TTD数据库“Acute gout arthritis”关键词获得AGA疾病相关作用靶点去除重复靶点后得到靶点662个。将所得的有效化合物相关靶点与两种疾病的相关靶点通过VENNY2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集获得短穗兔耳草治疗ALD和AGA的共同作用靶点253个。

2.3 共有靶点的网络分析将获得的有效成分、疾病、共有靶点信息导入Cytoscape3.7.2绘制有效成分-疾病-共有靶点网络图，其中包括2个疾病，7个活性成分，252个共有靶点。结果显示MAPK8、MAPK14、JAK2、KDR、IGF1R、PPARG、MMP12、MMP13、MMP3、HMGCR、HCK、F2、CTSB、AKR1B1、SYK、SRC为七个活性成分的共有靶点。同时，结果表明短穗兔耳草的有效成分的靶点数均大于1，而同一靶点也会对应多个有效成分，说明短穗兔耳草治疗疾病是通过多个成分作用于多个靶点而产生药效。

将获得的253个共有靶点在string平台中进行PPI网络分析，构建的PPI网络包括252个节点(其中有1个靶点未参与蛋白互作)，5 122条相互作用连线，将相互作用关系导入Cytoscape中，通过Network analysis工具，根据节点度和中介中心度筛选出节点度和中介中心度靠前的20个作为关键靶点，见Tab 2。将20个关键靶点导入DisGeNET数据库中，获取蛋白归属信息，见Tab 3。结果显示，关键靶点主要涉及信号分子(signaling molecule)、激酶(kinase)、转移酶(transferase)、转录因子(transcription factor)。

Tab 2 Analysis of topological properties of common disease targets(top 20)

Tab 3 Protein assignment information for top 20 key targets in common targets

2.4 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析根据1.5的分析方法对253个共有靶点进行GO富集分析与通路分析，得到1 129个生物过程，57个细胞学组分，118个分子功能以及44条信号通路。分别取前15个条目进行可视化条形图，见Fig 1。GO富集分析由三个部分组成，包括生物过程、分子功能和细胞组分。其中生物过程分析结果显示，对有机物质的反应、细胞增殖调节、对内生刺激的反应、对损伤的反应、对激素刺激的反应等生物过程在短穗兔耳草治疗ALD和AGA疾病的过程中均发挥重要作用。分子功能分析结果显示，其主要与细胞因子活性、相同蛋白质结合、蛋白质均二聚活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白质二聚活性有关；细胞组分分析结果显示，其主要存在于细胞外空间、细胞外区域部分、细胞外区域、细胞溶质中。

KEGG富集分析结果显示，Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、FcεRI信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路在短穗兔耳草治疗ALD和AGA疾病的过程中均发挥重要作用。

2.5 分子对接验证本研究取节点度排名前的4个靶点蛋白INS、IL-6、ALB、TNF与7个化合物进行对接，验证其相互作用活性。其中IL-6、ALB、TNF能与7个化合物中的一个或几个成功对接，如Tab 4所示，部分配体-蛋白相互作用(ABCD四张图分别为2E7A与Bicuculline，3DTL与Bicuculline，2E7A与Chryseriol，6J7E与Chryseriol的对接结果)，见Fig 2。荷包牡丹碱、柯伊利素均能与蛋白ALB、TNF结合，且结合能远小于5 kcal·mol-1，表明这两个化合物较其他成分具有良好的活性；同时，荷包牡丹碱还能与IL-6蛋白结合；而IL-6能与邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯对接成功，TNF蛋白也能与木犀草素和Arvenin I对接成功；表明短穗兔耳草能通过多成分多靶点发挥其治疗疾病的作用。荷包牡丹碱通过氢键、碳氢键、烷基及π-烷基的疏水作用等与2E7A残基ARG103、PRO100、CYS69等结合；通过氢键、烷基及π-烷基的疏水作用等与3DTL残基ASP324、ARG209、ALA213等结合；柯伊利素通过氢键、碳氢键及疏水作用与2E7AY与6E7A结合。从价键角度来讲这几个化合物与配体都能通过多种价键相结合，说明其具有良好的结合稳定性。

Tab 4 Docking results of molecules and proteins

Fig 1 GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis

Fig 2 Ligand-protein interaction diagram

3 讨论

痛风在藏医的范畴又叫“直合乃”，属于热性疾病，认为其是由于“血隆”失调而引发的疾病，初期表现皮肤红肿热痛而后变硬发青产生剧痛，后期扩散至关节筋骨，若不及时治疗疾病逐渐加重致行走困难，难以治疗。其可分为隆型、赤巴型、培根型和血型四种，而现代医学认为的急性痛风性关节炎与藏医的赤巴型痛风较为相似，表现为发热红肿，疼痛难忍[12]。据《四部医典》记载肝病的发病原因可分为内因和外因，外因多由感受湿热疫毒之邪所致，使体内隆、赤巴、培根、黄水和血紊乱失调[13]。酒性湿热，饮之过量可致湿热酒毒之邪伤肝损脾，使肝失疏泄、脾失运化，日久胶结停于胁下甚至结为痞块形成酒癖而致慢性酒精性肝损伤的发生。同时，前期研究表明短穗兔耳草有良好的抗痛风及抗各种肝损伤的疗效[7-10]。因此这从理论和实践上解释了短穗兔耳草用于慢性酒精性肝损伤和痛风性关节炎两种疾病的原因，同时为我们进一步研究其分子机制提供了基础。

结合网络药理学和分子对接研究结果，本研究从短穗兔耳草中筛选得到7个有效化合物，分别为邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、连翘苷、β-谷甾醇、荷包牡丹碱、柯伊利素、木犀草素、Arvenin I。分子对接结果显示荷包牡丹碱、柯伊利素、木犀草素能与3个蛋白中的一个或几个成功对接，提示其可能是短穗兔耳草治疗两种疾病的有效成分。其中已有研究表明木犀草素对急性酒精性肝损伤[14]和急性痛风性关节炎[15]有一定的治疗作用,连翘苷能够通过抑制细胞凋亡在酒精性肝损伤中发挥保护作用[16]。其他化合物尚未见相关报道，有待进一步的研究。研究通过节点度和中介中心性筛选了排名靠前的20个靶点作为关键靶点，其中IL-6、TNF、IL-10、IL-1β、IL-4属于炎症细胞因子，参与各种炎症反应的进行，刺激趋化因子CXCL8、CCL2等的产生；ALB通常被用来评价机体营养状况，同时也能够反应机体的消耗程度，如与炎症反应、感染性疾病、肿瘤等相关；MAPK能够参与细胞生长、增殖、分化、癌变、转移、凋亡等过程。已有研究表明IL-6、ALB、TNF、STAT3、CXCL8、IL-10、TLR4、IL-1β、IL-4等在治疗酒精肝和痛风或痛风性关节炎中发挥重要作用。

本研究发现短穗兔耳草治疗慢性酒精性肝损伤和痛风性关节炎的机制可能与调控Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、FcεRI信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路等通路有关，有研究已证实了短穗兔耳草能够通过调节Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路发挥抗慢性酒精性肝损伤及痛风性关节炎作用[17-18]。同时，有研究表明酒精性肝损伤和痛风性关节炎皆与PPAR信号通路密切相关；JAK-STAT信号通路能够干预调控肿瘤、呼吸系统疾病、血液疾病、自身免疫疾病(急性痛风性关节炎、类风湿性关节炎等)、肝脏疾病(非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、肝纤维化等)等的发生，但目前尚无与酒精性肝损伤的研究，这些研究基本与本研究的结果相似，一定程度上表明了网络药理学研究方法的可靠性。但是关于两种疾病与FcεRI信号通路、T细胞受体信号通路的研究尚无报道，有待于进一步验证。

本研究采用网络药理学和分子对接的方法初步的研究了短穗兔耳草对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节的调控作用。研究根据生物利用度和类药性筛选出7个有效化合物，作用于5 027个靶点，找寻两种疾病相关靶点4 212个，最后共得到短穗兔耳草治疗两种疾病的共有靶点253个。共有靶点经过生物信息富集分析，得到1 129个生物过程，57个细胞学组分，118个分子功能以及44条信号通路。分子对接结果显示荷包牡丹碱、柯伊利素、木犀草素可能为短穗兔耳草治疗两种疾病的有效化合物。该研究体现了短穗兔耳草多成分、多靶点、多途径的特点，可为进一步研究短穗兔耳草的作用机制提供参考。但是，该方法由于数据库不完全的原因存在一定的局限性，只能为我们提供初步的探索，后期的研究仍需通过实验进行进一步的验证。