三斑海马骨骼染色方法改进及骨骼结构特点研究

周胜杰 胡静 杨其彬 杨蕊 于刚 马振华

摘要：【目的】明確三斑海马（Hippocampus trimaculatus）的骨骼特点，为三斑海马的种类鉴定提供技术支持，同时为海马的基础生物学积累数据。【方法】在透明化骨骼染色法的基础上，进一步改进三斑海马骨骼染色方法，并对三斑海马的骨骼特点进行细节性描述。【结果】相对于传统的透明化骨骼染色法，改进后的透明化骨骼染色法在再脱色与透明环节中，通过添加少量H2O2有效去除组织中残留的染色剂，同时添加少量2% KOH促使组织更加透明，且在装瓶步骤中正向直立放置三斑海马骨骼标本。三斑海马的背鳍鳍条数为19～21条，胸鳍鳍条数为18～19条;其头部有独特结构：有多个凸出的棘，颌骨部分构成管状结构，鳃盖后缘无鳃孔，鳃孔开口在鳃盖后缘正上方头顶位置;三斑海马自头部以下至尾端体表均由菱形骨片构成的骨环包被，胸腹部共有12节骨环，除第11和12节骨环外，每节骨环均由7片不规则的菱形骨骼构成，骨环内部及骨环间存在滑道结构，为运动和摄食提供立体空间;尾部共有40～41节骨环，每节骨环均由4片菱形骨片构成，骨环向尾末端逐渐缩小，骨环间也存在滑道结构，具攀附功能。【结论】改进后的透明化骨骼染色法更适合于三斑海马骨骼染色，操作便捷，骨骼标本质量高。三斑海马具有独特的头部骨骼结构与摄食方式，自头部以下全身包被骨骼，外骨骼主要由菱形骨片构成，但构成不同部位骨环的菱形骨片数量不同;骨环内部及骨环间存在滑道结构，为三斑海马的运动和摄食提供立体空间，因此可通过胸腹部膨胀围度判断三斑海马的营养状况及雌性三斑海马的性腺发育情况。

关键词： 三斑海马;骨骼结构;骨环;菱形骨片;透明化骨骼染色法

中图分类号： S965.399                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1387-08

Abstract：【Objective】Explored the detailed characteristics of Hippocampus trimaculatus skeletons， provided technical support for the type identification of H. trimaculatus， and accumulated data for the basic biology of H. trimaculatus. 【Method】On the basis of the transparent skeleton dyeing method， a special staining method for H. trimaculatus was improved to describe its skeleton characteristics， and the skeleton characteristics of H. trimaculatus were described in detail.【Result】Compared with the traditional transparent skeleton staining method， at decolorization and transparency procedures， the improved transparent skeleton staining method effectively removed the tissue residue with the addition of a small amount of H2O2， and a small amount of 2% KOH to make the tissue more transparent， and the placement of H. trimaculatus skeleton samples upright in the bottling step. The number of dorsal fins in H. trimaculatus was 19-21， and the number of pectoral fins was 18-19. The head of H. trimaculatus had its unique structure： many salient apines， the jaw ske-leton formed a tubular structure， and there was no gill hole at the trailing edge of the gill cover. The opening of the gill hole was directly above the head of the gill. H. trimaculatus was covered by a ring of diamond-shaped skeletons from head to tail body surface to provide protection and support for it. There were 12 bone rings in the chest and abdomen. Except for the 11th and 12th section， each ring of the thorax and abdomen is composed of 7 irregular diamond-shaped skeletons. There was a unique sliding structure inside and between the skeleton rings， which provided a three-dimensional space for movement and feeding. Each ring of the tail skeleton was composed of 4 diamond-shaped skeletons. There were 40-41 bone rings in the tail， each ring is composed of 4 diamond-shaped skeletons， and the skeleton pieces shrink toward the tail gra-dually form a square skeleton ring and there was a sliding structure between the skeleton rings to provide activity space for the climbing action. 【Conclusion】The improved transparent skeleton staining method is more suitable for H. trimaculatus skeleton dyeing， with convenient operation and high quality of skeleton specimens. H. trimaculatus has a unique head skeleton structure and feeding mode. The whole body below the head is surrounded by the skeleton， and the exoskeleton is mainly composed of rhomboid skeleton. However， the number of rhomboid skeletons constitute different rings in diffe-rent parts; there is a sliding structure inside and between the bone ring to provide stereoscopic space for the movement and feeding of H. trimaculatus， so the nutrition status of H. trimaculatus and the gonadal development of the female H. trima-culatus can be determined through the chest and abdominal expansion circumference.

Key words： Hippocampus trimaculatus; skeleton structure; skeleton ring; diamond-shaped skeleton; transparent skeleton staining method

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN340）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD55）; Guangxi Innovation Driven Development Special Project（Guike AA18242031）

0 引言

【研究意義】三斑海马（Hippocampus trimaculatus）俗名龙落子，也称水马或马头鱼，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）海龙目（Syngnathiformes）海龙科（Syngnathidae），因其第1、4和7节各具一块黑斑而得名，是珍稀的海洋药源性和观赏性动物。海马具有极高的经济价值，在我国素有“南方人参”之称（林强等，2007）。三斑海马主要分布于中国、印度、新加坡及印度尼西亚等国家的沿海地区。在我国东海和南海分布较广，福建、广东和海南的沿海地区均有分布（骆大鹏等，2016）。骨骼研究可为鱼类的生长发育、营养状况及生理构成等提供有利佐证，从而推导出其发育状况及不同物种间的差异，对揭示鱼类的早期形态、结构、摄食和运动具有重要参考价值（周胜杰等，2018b;曹晓颖等，2019）。因此，加强鱼类骨骼研究不仅能丰富其生物学资料，还能为制定科学养殖方案提供重要的科学依据。【前人研究进展】骨骼标本的制作通常采用蒸煮剔骨法和透明化骨骼染色法，其中透明骨骼标本因具有直观、真实的特点，在动物学、生物学及影像学等专业领域已有广泛应用，同时为骨骼发育研究提供了直接而有效的形态学观察方法（刘万祥等，2002）。至今，有关鱼类骨骼的研究已普遍开展，涉及种类有黄尾鰤（Seriola lalandi）（Andrades et al.，1996）、欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）（Abdel et al.，2004;Georgakopoulou et al.，2007）、红罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. mossambicus）（杨凡，2007）、齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）（杨世勇等，2012）、卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）（Prestinicola et al.，2013;郑攀龙等，2014）、红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus）（程大川等，2017）、鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）（吕雪娇等，2018）、尖吻鲈（Lates calcarifer）（周胜杰等，2018a，2018b）及西伯利亚鲟（Acipenser baeri）（刘钊等，2019）等。鉴于海马固有的特殊营养价值及药用价值，针对海马种苗培育（邓钢等，2005;骆大鹏等，2016）、养殖技术（牟金婷等，2017）、药用价值（吴靖娜等，2017;于曼曼，2018）、病害防治（杨求华等，2017）及营养成分（王清蓉等，2018;闫珍珍等，2019）的研究已有较多报道，有关三斑海马的研究主要集中在生理生化、成分提取纯化、开发利用及人工繁育技术等方面（李蓉等，2009;袁根军和陈再忠，2011;姜展志等，2013;陈莉萍等，2016;骆大鹏等，2016），但对于海马骨骼方面的研究相对较匮乏。梁亮堂（2019）通过透明化骨骼染色法成功鉴定出海马种类，但制作的海马标本透明度不高，骨骼细节模糊，说明海马透明化骨骼标本制作方法仍然有待进一步改进。【本研究切入点】为了适应生存环境，海马已进化出独特的骨骼构造，不同海马种类的骨骼构造也有所差异（郭文场等，2016），因此急需探索出一种简单有效的方法进行种类鉴别，但至今鲜见针对三斑海马骨骼染色方法及相关骨骼细节性描述的研究报道。【拟解决的关键问题】在透明化骨骼染色法的基础上，进一步改进三斑海马骨骼染色方法，并对三斑海马的骨骼特点进行细节性描述，为三斑海马的种类鉴定提供技术支持，同时为海马的基础生物学积累数据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

三斑海马采自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心基地的育苗与养殖车间。三斑海马样品用5%丁香酚麻醉后直接置于45%中性福尔马林中固定，确保体型不变形，常温保存;也可采用死亡的海马尸体进行制作。茜素红（Alizarin redmonohydrate）购自天津市大茂化学试剂厂，无水乙醇、硼砂及氢氧化钾等试验试剂购自广州普博欣生物科技有限责任公司。脱水液：95%乙醇（无水乙醇∶去离子水=95∶5）;漂洗液：1%氢氧化钾（15 mL）和3%双氧水（85 mL）;茜素红染色液：将0.06 g茜素红粉末溶于100 mL的0.8%氢氧化钾溶液中。

1. 2 试验方法

参照刘万祥等（2002）、李文等（2008）、梁亮堂（2019）的方法，三斑海马骨骼染色的主要步骤包括：（1）固定与脱水;（2）脱脂;（3）复水;（4）染色;（5）脱浮色;（6）脱色;（7）再脱色与透明;（8）去气泡;（9）梯度透明;（10）装瓶。

2 结果与分析

2. 1 三斑海马骨骼染色方法的改进效果

三斑海马具有外骨骼，但其表皮与外骨骼连接紧密，无法在固定与脱水时去除表皮或表皮颜色，因此需在脱色环节去除;同时增加脱脂环节，减少标本中黄色脂肪对标本透明度的影响。在再脱色与透明环节中，通过添加少量H2O2有效去除组织中残留的染色剂，同时添加少量2% KOH促使组织更加透明。在最后的装瓶步骤中，可正向直立放置三斑海马骨骼标本（表1）。透明骨骼染色标本制作完成后，骨架坚硬结实不易散架，骨骼清晰，色泽鲜艳，透明度高，便于观察三斑海马骨骼形态（图1）。

2. 2 三斑海马骨骼详细描述

2. 2. 1 三斑海马的鳍条数量 海马鳍条数量是鉴别海马种类的重要依据之一。通过骨骼染色可知，三斑海马的背鳍鳍条数量为19～21条，胸鳍鳍条数量为18～19条，臀鳍鳍条数量为4～5条（成年雄性三斑海马无臀鳍），与已报道的刺海马胸鳍鳍条数量相似，因此无法通过鳍条数量区分这2种海马。三斑海马背鳍和胸鳍的鳍条数量与其他海马存在明显差异（表2），可有效区分开来，为海马种类的骨骼鉴定法提供了有利依据。

2. 2. 2 三斑海马的头部骨骼 三斑海马头部骨骼（图2）与通常意义下的鱼类头部骨骼存在明显差异，其下颌骨与上颌骨向前延长，吻长占整个头长的50%左右，吻前端向上呈45°开口，属上口位，通常状态下吻端略低于眼睛，便于捕食;鳃被鳃盖包被，胸鳍基部紧贴着鳃盖后缘，鳃盖后缘无开口，但在头顶脑后左右两侧各有1个出水孔，呼吸时海水由此孔喷出[出水孔类似于海洋哺乳动物（鲸鱼）可向上喷水]。

2. 2. 3 三斑海马的胸腹部骨骼 三斑海马具有外骨骼和脊柱，其头部以下至背鳍末端为胸腹部，内脏位于此区域内（图3）。构成胸腹部轮廓的为菱形或类菱形骨骼（片），每片菱形骨骼均有2条对角线骨棱，且2条骨棱相互垂直向外突起，骨棱交点处具有1个向外凸出的棘，不同部位的棘长有所差异。菱形骨片相互连接构成骨环。胸腹部共有12节骨环，自颈部向下第1～10节骨环均由7片不规则的菱形骨片构成，骨片大小随身体结构变化而改变;第11节骨环有8片菱形骨片，臀鳍固定于此处（性成熟雄性三斑海马腹部有育儿囊，无臀鳍）;第12節骨环有6片菱形骨片，且腹面2片菱形骨片未连接在一起，形成泄殖孔。三斑海马背鳍固定于第10、11和12节骨环背面的2片菱形骨片之间。第1、4、7和11节骨环的棘较长，明显长于相邻的骨环。相邻骨环间由可滑动的滑道结构相连，上一骨环菱形骨片下角延长伸入下一骨环菱形骨片下方，为三斑海马运动或摄食提供活动空间。每节骨环中，菱形骨片朝向腹面的角均向腹面延长至下一菱形骨片下方（背部2片菱形骨片及正腹部菱形骨片除外），构成可滑动的结合点，为三斑海马进食或发育提供伸缩空间。泄殖孔位于第10和11节骨环间的腹面，5片菱形骨片围绕着泄殖孔，是三斑海马极少无骨骼覆盖的区域。

2. 2. 4 三斑海马的尾部骨骼 三斑海马尾部共有40～41节骨环（图4），每节骨环均由4片菱形骨片构成，骨环向尾末端逐渐缩小，最终凝聚为一点。第16、21、25、29和33节骨环菱形骨片上的棘凸出较多，明显高于相邻的骨环。相邻骨环间由可滑动的滑道结构相连，上一骨环菱形骨片下角延长伸入下一骨环菱形骨片下方，为三斑海马提供尾部弯曲及攀附功能。

3 讨论

三斑海马体色可随环境的变化而改变，其体色最主要的特点是体侧背方第1、4、7节各具一块黑斑，但在不同时间或地点这3块黑斑可能会消失。由于海马体色可变，且不同海马种类间外观近似，给海马种类的直观鉴定带来很大困扰，现阶段海马种类较准确的鉴定方法为分子鉴定（董世雄等，2017），但分子鉴定效率低、成本高，不适宜作为广谱性鉴定方法。目前常用的鱼类骨骼观察及描述方法有阿利新蓝—茜素红双染色法（Darias et al.，2010a，2010b;马慧等，2011;Cobcroft and Battaglene，2013）、micro CT扫描技术（张宁等，2012）及透明化骨骼染色法（梁亮堂，2019）等。其中，透明化骨骼染色法具有可直接观察标本空间结构、成本低、操作简单及不易褪色等优点，已成为最常用的鱼类骨骼染色方法。三斑海马的骨骼构造与传统鱼类存在明显差异，采用传统的透明化骨骼标本制作方法不能制作出高质量的三斑海马骨骼标本。为此，本研究对透明化骨骼标本的制作方法进行改进，利用茜素红的特点对三斑海马进行骨骼染色并制作透明化骨骼标本。针对三斑海马具有坚固的外骨骼，且其表皮紧帖在骨环及骨间组织上的特点，本研究缩减了固定环节中的剥皮工序，体表颜色通过在脱色环节中去除;并增加脱脂环节，减少标本中黄色脂肪对标本透明度的影响。在脱色与透明环节，通过添加少量H2O2有效去除组织中残留的染色剂，添加少量2% KOH促使组织更加透明。此外，在装瓶步骤中，可正向直立放置三斑海马骨骼标本。改进后的透明化骨骼染色法具有以下优点：（1）骨架坚硬结实不易散架;（2）透明度高，易观察骨骼形态;（3）骨骼结构更清晰，色泽鲜艳;（4）可在再脱色与透明环节进行微调与修正等。

鱼类骨骼系统包括外骨骼和内骨骼，外骨骼主要由鳞片构成，内骨骼包括肋骨、中轴骨与跗肢骨骼（曹晓颖，2019）。鱼类的骨骼特征与其生长发育和生态适应性密切相关（王永梅和唐文乔，2014），因此，开展三斑海马骨骼特征研究有助于了解其发育特征及生态适应性，同时为海马的分类鉴定提供参考依据。三斑海马外骨骼与传统意义上的鱼类存在明显差异，三斑海马具有菱形骨片构成的外骨骼，没有肋骨和鳞片，菱形骨片间紧密相连，几乎包被了除头部以外的所有区域，相邻4片菱形骨片间有间隙，泄殖孔处无骨骼包被。鳍条数量是现阶段快速鉴定海马种类的重要方法之一（梁亮堂，2019）。本研究结果表明，三斑海马的背鳍鳍条数为19～21条，胸鳍鳍条数为18～19条，与郭文场等（2016）的研究结论基本一致，即与其他海马种类（刺海马除外）存在明显差异。三斑海马的臀鳍鳍条数为4～5条，但由于成年雄性海马会在其腹部下方发育形成育儿袋，而臀鳍退化，因此一般不会将臀鳍鳍条数量作为鉴定海马种类的指标。

鱼类的头部骨骼具有重要功能，包括捕食、呼吸、保护大脑及提供支撑等，因此头部骨骼构造的特点能反映该物种的摄食方式及呼吸特征等（杨世勇等，2012;黄永彬等，2019）。三斑海马头部骨骼较特殊，与普通鱼类不同，其最具特点的部位是具有坚硬的棘、管状吻和头顶鳃孔。三斑海马头部具有多个坚硬的棘，顶端锋利，在野生状态下起保护作用;上、下颌骨延长并结合形成一根管状通道，吻端开口向上方倾斜，与颌骨形成45°夹角，吻前端下颌骨可自由打开或闭合，配合摄食与呼吸;吻长占整个头长的50%左右，三斑海马摄食的饵料必须经过吻部中间管状部位的狭窄通道，因此限制了三斑海马摄食饵料的规格。三斑海马属于机会性捕食者，2只眼睛可独立转动，视野宽阔，通常会将自身缠绕于大型藻类或绳索等条状固体上（郭文场等，2016），有适合口径的饵料经过时调整头部位置，使饵料处于吻端正前方，双眼视线重合判断并调整饵料与吻端距离，后头部突然前伸并吸水，通过细管状结构近距离产生较大压力差而将饵料吸入口中。三斑海马头部骨骼的另一特点是鳃盖后缘没有开裂，吻端吸入的水通过头顶出水孔喷出。这种出水方式可有效减少呼吸运动对胸鳍的干扰，防止伴随呼吸运动不自主向前游动。

鱼类的胸腹部骨骼通常是由脊椎骨和肋骨等构成，但三斑海马主要由脊椎骨和菱形骨片构成。菱形骨片紧密连接构成骨环，骨环相互连接构成胸腔和腹腔，为胸腹部提供支撑与保护。本研究发现，三斑海马胸腹部共有11节骨环，与郭文场等（2016）研究发现的数目一致。骨环间具有滑道结构（下方菱形骨片上角形成V字结构扣在上方菱形骨片下角的骨棱上，菱形骨片下角轻微延长，构成可短距离移动的滑道），可实现小范围滑動，为三斑海马提供胸腹部弯曲的空间;骨环内部同样具有滑道结构，骨环中的菱形骨片朝向腹面的角均向腹面延长至下一菱形骨片下方（背部2片菱形骨片及正腹部菱形骨片除外），构成可滑动的结合点，为三斑海马横向围度提供伸缩空间。因此，可通过胸腹部膨胀围度判断三斑海马的营养状况及雌性三斑海马的性腺发育情况。此外，第1、4、7和11节骨环菱形骨片的棘较长，明显长于相邻的骨环，可能与三斑海马的早期发育有关。

鱼类尾部骨骼一般由脊椎骨、鳞片和尾鳍等构成，但三斑海马与之不同，其尾鳍退化，脊椎骨在尾部中央靠背面，外部由菱形骨片包被提供保护与支撑，尾部可向腹面卷曲或左右摆动，可在水中攀附于大型藻类或绳索等条状固体上。三斑海马尾部共有40～41节骨环，每片菱形骨片均沿着较短的对角线向内弯曲，形成90°角，4片菱形骨骼构成1节骨环。骨环间也存在滑道结构（与胸腹部骨环间结构相同），允许小范围滑动，促使腹面的活动范围更大，因此三斑海马可卷曲尾部，且具有攀附功能。

4 结论

改进后的透明化骨骼染色法更适合于三斑海马骨骼染色，操作便捷，骨骼标本质量高。三斑海马具有独特的头部骨骼结构与摄食方式，自头部以下全身包被骨骼，外骨骼主要由菱形骨片构成，但构成不同部位骨环的菱形骨片数量不同;骨环内部及骨环间存在滑道结构，为三斑海马的运动和摄食提供立体空间，因此可通过胸腹部膨胀围度判断三斑海马的营养状况及雌性三斑海马的性腺发育情况。

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（責任编辑 兰宗宝）