MiR-27与miR-29在糖尿病肾病发病中的作用及相关中药研究应用＊

葛 凡，薛 梅

（南京中医药大学中医学院/中西医结合学院 南京210023）

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病病人最多发常见的微血管并发症。该病病变通常累及全肾，临床上以持续蛋白尿、肾小球滤过率（Glomerular Filtration Rate，GFR）进行性下降、高血压、水肿与贫血为主要发病特征。全世界范围内，随着人口老龄化程度加大和糖尿病患病率的持续增长，DN的发病率逐年递增，已成为终末期肾脏病（尿毒症）的第二诱因，亦是糖尿病患者致死致残的重要原因。DN的发病机制一般认为是糖尿病引发多种代谢紊乱共同作用的结果，如遗传易感性、糖代谢紊乱、肾脏血流动力学的改变、氧化应激及激素异常等均起到非常重要的作用[1-2]。西医治疗以控制血压、控制血脂、抗炎为主[3]。临床上，PPAR-γ（过氧化物酶体增殖物激活受体-γ）激动剂、雷公藤多苷、卡托普利和螺内酯的组合等[4-5]均可用来治疗DN，但效果有限，且存在一定的副作用。

DN在中医学归属于“消渴”、“肾消”范畴，它是由于消渴病程日久，迁延引发水肿、腰痛、尿浊等并发症，与禀赋不足、饮食不节、情志不舒、劳逸过度、失治误治等导致的脏腑功能失调有关，基本病机为“虚、瘀、浊”，脾肾两虚是其常见的证型[6]。DN由于病情特殊，一般需要较长的治疗周期，患者长久服药治疗造成气虚无力、瘀血阻滞，而瘀血阻滞造成患者肾脏脉络不通，进一步造成患者产生蛋白尿，而蛋白尿顽固难消，治标需治本，必须活血化瘀方能见效。因此，在治疗上早期应注重“扶正”，多用益气养阴之法，兼顾调理肝脾肾三脏气机；病情进展较深，病理产物积聚，则治以“驱邪”为主[7]。中医药的优势在于“整体论治”和“多靶点干预”，中药复方的疗效润物无声、平波缓进，且无突出不良反应，临床可长期服用，愈来愈受到广泛的重视和认可。中医辨证论治的治疗方法较西医治疗更为有效，能明显改善患者的临床症状，总的有效治愈率可达到80%以上（P<0.05）[8]。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内源性约含有19~24个核苷酸的非编码小RNA。MiRNA可以减少目的基因的表达，调控细胞增殖、凋亡和分化的过程[9]。近年来，随着人们对肾纤维化与miRNA关系的深入研究发现，在肾纤维化各进展期中，miRNAs通过抑制靶基因，调控巨噬细胞极化、转化生长因子、结缔组织生长因子、血管紧张素II、上皮间充质转化、细胞外基质堆积等，抑制纤维化信号通路进而影响肾纤维化。文献报道，MiR-571、miR-152、miR-1303、miR-192、miR-200、miR-21、miR-146、miR-23、miR-145、miR-126、miR-29、miR-377等多种miRNAs均参与了DN的发生与发展过程[10-12]。在前期实验中，我们用已定量成分的中药方剂含药血清干预高糖培养的人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK2），细胞样本高通量miRNAs测序，结果发现与模型组相比，样品组20种miRNAs具有显著差异。通过qPCR进一步验证与DN相关的5种miRNAs表达变化发现，其中，miR-27a-5p表达下调更为显著。因此，我们选择实验中发现的miR-27和miR-29两种表达有显著差异的miRNA参与调控糖尿病肾病关系、下游信号通路及相关中药研究应用予以综述。

1 miR-29参与调控DN的分子机制

MiR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，它们只在2-3个碱基（miR-29a和miR-29b1以及miR-29c和miR-29b2）上有所不同，分别由位于7号染色体或1号染色体上的两个基因串联编码和转录。MiR-29已被证明参与抑制细胞外基质蛋白的合成，表明具有抗纤维化功能。Targetscan（靶点预测）预测程序表明[13]，miR-29家族有可能通过与其3'UTR结合，抑制多种胶原蛋白（col1a1、col2a1、col3a1、col4a1、col4a3、col4a5、col5a1、col5a2、col6a3等）的合成。同时，有研究结果表明[13]，miR-29家族异常表达，参与了肝脏、肾脏、心肌、肺等多个组织器官纤维化的发生与发展。可以确定miR-29参与了DN的发生与发展，有望成为治疗DN的一个重要靶点。

TGF-β/Smads是目前公认促肾纤维化最主要的信号通路，miRNAs通过抑制靶基因，正或负反馈作用于TGF-β/Smads及其他纤维化信号通路，在肾纤维化各进展期发挥调控作用。TGF-β1被认为是肾纤维化的关键介体，主要通过激活其下游Smad信号通路引起肾纤维化。

近期，有研究指出[14]，Smad3，而不是Smad2，是响应TGF-β1和TGF-β1/Smad3信号纤维化的关键信号传导途径，能够抑制miR-29表达发挥作用，促进肾脏纤维化。此外，miR-29也参与了DN肾纤维化的病理过程。在db/db小鼠DN的实验[15]研究中，miR-29过度表达减弱了肾小球系膜细胞中晚期糖基化末端（AGE）诱导的TGF-β/Smad3介导的纤维化；Western印记、免疫组织化学和实时PCR也表明，miR-29b治疗能抑制db/db小鼠的肾纤维化。同时，Qin等人[16]通过实验证明了miR-29是TGF-β/Smad3介导的纤维化的下游抑制剂。以上研究均提示，miR-29对肾脏能发挥一定的保护作用，需更进一步研究miR-29在肾纤维化中的作用，其可能具有进行性肾纤维化的治疗潜力。

miR-29已被证明在上皮细胞-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transformation，EMT）中发挥重要作用，可能有助于EMT的调节。研究表明，TGFβ可以通过介导PI3K-AKT信号通路，实现对胶原等细胞外基质表达的调节；MiR29的过表达可致使PI3K和AKT表达细胞磷酸化水平明显下降，并抑制其对细胞的迁移和侵袭，从而抑制PI3K-AKT信号通路，减低胶原的表达[17]。此外，Hu等人[18]发现miR-29b通过PI3K/AKT信号通路在Ang II诱导的EMT负调控中发挥重要作用。因此，提高miR-29水平或阻断PI3K/AKT信号通路可能是治疗肾间质纤维化的新靶点。

Wnt/β-catenin信号通路是由配体蛋白Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，在介导细胞增殖、分化以及极化过程中具有重要作用[19]，能通过抑制糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的β-连环蛋白（β-catenin）降解等作用来诱导EMT转换。研究表明[20]，miR-29的过表达抑制了TGF-β诱导的Wnt3α的表达，从而间接抑制了βcatenin活化的过程。所以，miR-29可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，实现对胶原表达的调控，减少EMT的积聚。

PTEN（磷酸酶基因）是miR-29的直接靶标，miR-29a通过靶向下调PTEN促进Akt磷酸化，进而促进TGF-β1诱导的细胞上皮间质转化能力[21]。PTEN能负性调节Akt,降低Akt磷酸化水平，而Akt能促进EMT发生。梁媛等人[22]通过实验发现，抑制miR-29a的表达水平可能通过上调靶基因PTEN，推动Akt磷酸化,抑制EMT的发生。

2 miR-27参与调控DN的分子机制

MiR-27家族，包括miR-27a和miR-27b，是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝和心血管疾病生理过程中的新的关键调节因子。值得注意的是，近年来报道I型和II型糖尿病患者血循环miR-27a水平增高，对行肾活检的DN患者52例研究发现患者血浆miR-27a上升，肾功能恶化。体外研究发现miR-27a可通过靶向抑制PPAR-γ而诱导NRK（大鼠肾细胞）-52E细胞纤维化，其机制或许与TGF-β1/Smad3通路的激活有关[23]。因此，研究miR-27如何调控DN疾病进程，并明确miR-27靶基因及与下游信号通路的关系，将为寻找或阐明崭新的治疗药物与方法提供重要的理论依据。

研究发现[24]，PPAR-γ是miR-27a的直接下游靶基因，miR-27a通过直接靶向PPAR-γmRNA的3'UTR使其磷酸化，抑制PPAR-γ水平，进而使TGF-β1/Smad3信号通路激活，促进ECM的产生及蓄积。因此，抑制miR-27a的过表达，可能能够有效减少ECM的积聚。

Wnt3a已被证实为miR-27a-3p的靶基因。MiR-27a-3p可能通过靶向沉默Wnt3a，抑制β-catenin核转位,从而抑制Wnt3a/β-catenin信号通路，减少Col1、Col3合成[25]，间接减少ECM的积聚。

Ras/Raf/MEK/ERK信号传导途径中有四种核心蛋白激酶，Ras、Raf、MEK和ERK。在细胞表面，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活通过配体与受体酪氨酸激酶（RTK）的结合而启动，然后在细胞核中，四种核心蛋白激酶Ras、Raf、MEK和ERK磷酸化，进而调节基因转录[26]。MiR-27a-3p可能通过干扰Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的转导，抑制ECM的合成与积聚[27]。

3 中医药干预下miRNAs参与调控DN的研究概况

中医治疗糖尿病肾病的方法很多，中草药是最主要的形式。以miR-27和miR-29为代表的miRNAs作为参与DN发生发展的重要物质，在中药单体、提取物或复方治疗DN的过程中，均能够通过上调或下调自身的表达，从而保护肾脏，达到改善DN的效果。我们总结了近年中药单体、提取物、复方治疗DN相关研究（表1），以期为后续临床研究及传统中药的应用拓展奠定基础。

表1 中药单体、中药提取物、中药复方治疗DN相关研究

续表

4 结语

DN是糖尿病主要的微血管并发症，肾间质纤维化是其主要病理变化之一。临床虽有一些药物可用，但它们只能暂时缓解症状或阻碍一些患者DN的进展。因此，我们迫切需要新的治疗策略来控制DN。目前，miRNA已被广泛用作DN临床诊断和治疗的生物标志物。肾组织、外周血和尿液中miRNA的特异性变化可通过不同的信号通路和靶点，调控炎症反应、氧化应激、代谢异常、免疫反应和纤维化，影响DN的进展，恢复正常的肾功能。中医药无论是单体、提取物或复方，都具有多途径、多靶点的协同作用。在DN发生发展过程中，以miR-27和miR-29为代表的miRNAs，在中医药干预下，可以通过抑制靶基因，进而调控上皮间充质转化和细胞外基质堆积等，抑制下游信号通路进而影响肾纤维化，达到改善DN的效果。然而，miRNAs与DN的研究和临床应用仍存在许多挑战，单个miRNA在转录和翻译水平上的确切调控和特异功能仍需全面了解，与DN诊断相关的miRNAs的前瞻性验证、大样本量、多中心、多民族患者研究仍然缺乏。为了更好地理解miRNAs在DN中的调控和功能，仍需要进行大量的研究。MiRNAs干预治疗DN的前景正在显现，今后，在中医药理论指导下，通过研究miRNA如何调控DN疾病进程，并明确miRNA靶基因及与下游信号通路的关系，将为寻找或阐明崭新的DN治疗药物与方法提供重要的理论依据。