房氏天灸1号对四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤的保护作用＊

高青，马红，王庆宸，曹海飞，钟莹，靳曲，马正特，王垣芳，房纳生

（1.滨州医学院烟台附属医院烟台264100；2.滨州医学院康复医学院烟台264003；3.滨州医学院药学院烟台264003；4.滨州医学院基础医学院烟台264003；5.山东省东营市神农生物科技有限公司东营257500）

天灸又名发泡灸、冷灸、自灸，是将某些刺激性的药物涂敷于穴位，引起局部皮肤充血红赤甚至发泡，借助药物对穴位的刺激，激发经气，疏通经络，调理气血，平衡阴阳，最终达到治病防病的目的[1]。该疗法具有适应证广、毒副作用少、经济、疗效可靠等优点，故近年来广泛应用于临床[2]。我国传统医学采用天灸疗法治疗肝脏疾病已取得较好疗效[3-6]。目前临床应用的天灸药方多以白芥子、斑蝥、甘遂、延胡索、丁香、肉桂、细辛等，配以诸如麝香、冰片等透皮引经药物，辅以姜汁、蜂蜜等调和而成[7,8]，但临床研究表明这些药方常会引起皮肤过敏、全身不适、局部皮肤破溃，后期有色素沉着等反应，导致患者依从不高[9]。

房氏天灸1号是山东省东营市神农生物科技有限公司房纳生总经理自主研发的天灸药方，多年的临床观察表明该方对于肝病、骨关节病等疗效确切，且副作用小，患者依从性好。但该药方对于肝损伤的保护作用尚无实验依据，其作用机制尚未明确。本实验旨在探讨房氏天灸1号及其联合复方联苯双酯对大鼠急性肝损伤的保护作用及其机制，为房氏天灸1号的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠50只，雌、雄各半，体质量180-220g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号SCXK(鲁)2014 0007，动物合格证号37009200012102，实验动物使用许可证号SYXK(鲁)2013 0020。分单笼饲养于滨州医学院药理研究室（山东省重点实验室）动物室，室温20-22℃，相对湿度30%-35%，自然采光，明暗周期12 h，清洁通风，自由摄食饮水，随时更换垫料。

1.2 主要试剂与仪器

房氏天灸1号（白芍、丹参、杜仲、栀子、白芨、五味子、乳香、没药、斑蝥、土鳖虫、白芥子、地龙等适量，80目粉碎成粉，混匀，用熬开的猪油调和成糊状，取适量黏附于直径3 cm的圆形医用胶布中心（中心部位药物所占直径为1 cm）制成房氏天灸1号药贴，各药均购于山东省东营市人民医院）；复方联苯双酯片（呼伦贝尔松鹿制药有限公司）；四氯化碳（国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（托雷斯和利贝雷斯公司）；谷丙转氨酶测试剂盒（宁波美康生物科技有限公司）；谷草转氨酶试剂盒（宁波美康生物科技有限公司）；碱性磷酸酶测试剂盒（宁波美康生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；总蛋白定量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫分析试剂盒和大鼠白细胞介素-6酶联免疫分析试剂盒（惠嘉生物）。微孔板酶标仪（美国，BIO-RAD公司）；ARCHITECT c16000全自动生化分析系统（美国雅培公司）；CX21奥林巴斯生物显微镜（日本OLYMPUS株式会社）。

1.3 分组、造模及给药

50只大鼠随机分为正常对照组、肝损伤模型组、复方联苯双酯组、天灸组、天灸+复方联苯双酯组，每组10只，雌雄各半。通过腹腔注射5%四氯化碳橄榄油溶液6 mL·kg-1[10，11]复制肝损伤模型，注射后禁食不禁水。

复方联苯双酯：每24 h灌服复方联苯双酯1次（剂量为3.2 mg·kg-1），共2次，服药24 h后造模。

肝损伤模型组：每24 h灌服蒸馏水1次，共2次，24 h后造模。

天灸组：用剃须刀将大鼠背部及左右前肢上部区域的被毛剃除干净，取穴参照《实验针灸学》动物标准穴位图谱[12]，肝俞穴位于大鼠背部第9胸椎棘突下缘与肩胛骨内侧缘之中点处，用记号笔标记肝俞穴和三角肌下缘并贴敷药贴。敷药后大鼠均以单笼饲养，24 h后造模，48 h后将药贴去除，用棉棒沾取少量生理盐水擦拭敷药部位，观察局部起泡现象并记录。敷药部位起泡，不必将其刺破，让机体自然吸收。

天灸+复方联苯双酯组：在天灸的同时灌服复方联苯双酯，24 h后造模。

1.4 标本采集

造模后24 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1进行麻醉，经腹主动脉采血置入分离胶促凝管中，静置30 min后，迅速送往滨州医学院烟台附属医院检验科；采血后摘取肝脏，称重并计算肝指数。肝指数=肝重(g)/体重(g)×100%。取肝右叶，按肝组织重量（g）与生理盐水体积（mL）比为1∶9的比例加生理盐水，用玻璃匀浆器研磨制成肝组织匀浆液，在4℃、3000 r·min-1的条件下离心10 min，吸取上清液，置于-20℃冰箱保存备用。切取部分肝左叶，固定于4%多聚甲醛溶液48h以上，常规制备肝组织切片和HE染色，显微镜下观察肝组织的形态学变化。

1.5 指标检测

按照试剂盒说明书方法，用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST)、碱性磷酸酶（ALP）的含量。按照试剂盒说明书，ELISA法检测肝组织匀浆液中总蛋白、MDA、GSH含量及SOD活力，并检测大鼠血清IL-6和TNF-α的含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝指数和肝功能的影响

与正常对照组比较，四氯化碳损伤模型大鼠肝指数增大，血清ALT、AST和ALT水平升高（P<0.01）。复方联苯双酯、天灸组的大鼠肝指数下降不明显，天灸+复方联苯双酯组大鼠肝指数下降明显，与模型组比较P<0.05；各给药组ALT、AST和ALP水平降低（P<0.05或P<0.01）（表1）。

表1 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝指数和肝功能的影响（Xˉ±SD，n=10）

2.2 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝脏抗氧化能力的影响

与正常对照组比较，四氯化碳损伤模型大鼠肝组织MDA含量增加，SOD和GSH含量降低（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，复方联苯双酯、天灸组及二者联合组SOD活力增加、GSH含量增加、MDA含量减少（P<0.01或P<0.05）（表2）。

表2 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝脏抗氧化能力的影响（Xˉ±SD，n=10）

2.3 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠血清炎症因子的影响

与正常对照组比较，四氯化碳损伤模型大鼠血清TNF-α和IL-6水平升高（P<0.01和P<0.05）；与模型组比较，复方联苯双酯组、天灸组及二者联合组的大鼠 血 清TNF-α和IL-6水 平 降 低（P<0.01或P<0.05）（表3）。

表3 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠血清炎症因子的影响（Xˉ±SD，n=10）

2.4 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝组织形态的影响

肉眼观：正常大鼠肝脏色泽红润，被膜光滑，质地柔软均匀；四氯化碳损伤模型大鼠肝脏暗红，光泽度较差，被膜下可见黄白色细小颗粒；复方联苯双酯组、天灸组及天灸+复方联苯双酯组大鼠肝脏的病理变化相对较轻。

镜下观：正常大鼠肝脏组织结构清晰，肝细胞索状排列，肝细胞形态和结构正常。四氯化碳损伤模型大鼠肝脏中央静脉周围的细胞水肿严重，细胞排列紊乱，界限不清，肝细胞坏死较严重，中性粒细胞浸润较明显。复方联苯双酯组、天灸组及天灸+复方联苯双酯组大鼠肝细胞损伤程度较轻，有灶性肝细胞水肿、坏死及中性粒细胞浸润，尤以天灸+复方联苯双酯组大鼠肝脏病理变化最轻（图1）。

图1 房氏天灸1号对四氯化碳诱导肝损伤大鼠肝组织形态的影响（HE×400）

3 讨论

四氯化碳（CCl4）是一种选择性肝毒性物质，其诱导的肝损伤能准确地反映肝细胞功能、代谢及形态学变化[13]。CCl4诱发急性肝损伤病理学表现为肝细胞弥漫性变性、坏死、炎性细胞浸润，与临床病毒性肝炎病理变化极为相似[10,14]，因而广泛用于保肝药物研究。

目前认为，CCl4诱导肝损伤涉及氧化应激、炎症介质释放、细胞凋亡等多种分子机制[13]。CCl4在肝经细胞色素P450代谢生成三氯甲基（CCl3·）和过氧三氯甲基（CCl3OO·）自由基，继而攻击细胞膜脂质，使肝细胞脂质发生过氧化性损伤，导致肝细胞变性和坏死[15]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的终产物和重要标志物，它能与膜蛋白酶结合变性，同时增加膜通透性，改变细胞膜代谢、功能和结构，对机体细胞造成进一步损害[16]。此外，CCl3·和CCl3O2·自由基还可使肝脏抗氧化酶失活，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽巯基转移酶（GST），CCl3也可与谷胱甘肽（GSH）的巯基发生反应，导致GSH失活，从而降低肝脏的抗氧化能力[17]。因此，检测肝组织中MDA、SOD和GSH含量，可以反映肝细胞膜脂质过氧化损伤的严重程度。

肝细胞受到自由基的攻击破坏，使肝细胞膜通透性增加，导致细胞内ALT、AST、ALP等释放入血，因此通过检测血清ALT、AST、ALP水平可判断肝细胞损伤的程度[18,11]。在CCl4诱导肝损伤的过程中，肝细胞可分泌大量的炎症因子引起炎症反应，进一步加重肝细胞损伤[19]，其中TNF-α及IL-6与CCl4诱导的肝损伤高度相关[20,15]。因此，检测血清或肝组织TNF-α和IL-6等炎症因子水平可反映肝细胞炎症损伤程度。

本实验结果显示，四氯化碳肝损伤模型大鼠肝指数增大、血清ALT、AST和ALP水平升高、肝组织MDA含量增加、GSH含量减少、SOD活力降低，血清TNF-α和IL-6水平升高，且组织形态学检查可见肝细胞出现严重的弥漫性水肿、坏死和炎性细胞浸润，表明四氯化碳诱导急性肝损伤模型复制成功。

本实验结果表明，天灸能使四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠肝指数及血清ALT、AST、ALP降低、肝脏病理变化减轻，联合复方联苯双酯作用更显著，提示采用房氏天灸1号贴敷于肝俞穴和三角肌下缘及联合复方联苯双酯对于四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤具有保护作用；并且，天灸组及其联合复方联苯双酯组大鼠肝组织MDA含量降低、GSH含量和SOD活力增加，血清TNF-α和IL-6水平降低，提示房氏天灸1号对于四氯化碳诱导大鼠肝损伤的保护作用机制可能与提高肝脏抗氧化能力、减少IL-6和TNF-α等炎症因子释放有关。已有研究表明，天灸能增强机体清除自由基的能力，减轻自由基对脑和肝脏的损害[21-23]；天灸疗法可降低血清IL-6和TNF-α含量[24]。本实验结果与上述研究报道结果相一致。

中医认为，病毒等各种原因引起的肝炎及肝损伤，其病机主要是本虚标实、痰结血瘀，故而改善经络气血运行、扶正祛邪是治疗的关键[25]。天灸的疗效是通过经络腧穴和药物双重作用达到治疗效果[26]。天灸疗法可通过药物刺激穴位，激活经络，调和气血，天灸贴敷的药物经穴位皮肤入里，通过经络沟通脏腑，扶养正气、驱除病邪、安和脏腑[27-29]。天灸药物可刺激皮肤产生无菌性炎症渗出反应，引发起局部皮肤渗透性增加，从而促进药物有效成分吸收[29]。

肝俞穴与肝脏功能关系密切，刺激该穴位可起到疏肝利胆、活血化瘀之功效。肝主疏泻,又主藏血,肝之背俞穴肝之经气输注于背部之处,有疏肝利胆,活血化瘀之效[25]。针灸肝俞、期门等穴位，能降低血清转氨酶，改善肝功能[30]。三角肌下缘区域处有手阳明大肠经、手少阳三焦经经过，本实验选取肝俞穴配合肩臑穴及臑会穴两大阳经“会穴”，可同时刺激肝俞、手阳明大肠经及手少阳三焦经，可以协同疏通经络、改善气血运行，从而提高治疗效果。

目前应用于临床的天灸药方多以清·张璐《张氏医通》一书中的基本方进行加减，多以白芥子、甘遂、延胡索、斑蝥、丁香、肉桂、细辛等，配以麝香、冰片等透皮引经药物，辅以姜汁、蜂蜜等调和而成[7,8]。本实验采用房氏天灸1号，主要由白芍、丹参、杜仲、栀子、白芨、五味子、乳香、没药、斑蝥、土鳖虫、白芥子、地龙等中药组成。纵观全方，白芍、五味子收敛斑蝥、白芥子等之升扬有毒之性，并引诸药入肝经；丹参、乳香、没药等增强活血化瘀通经络之功；杜仲与五味子相合鼓阳气、补肝肾、以利扶正祛邪；栀子、地龙共用利肝胆、去黄疸、清病毒；白芨、乳香、没药去腐生肌、促进创面皮肤肌肉生长；斑蝥、白芥子共奏强行通经活络、激活经络穴位、拔除风寒湿毒之功；土鳖虫、地龙、白芍共用可治血鼓、散恶血、利膀胱、去水气、消水肿。诸药合用，寒热搭配、攻补兼施，协同扶正祛邪，相互制约副作用，配方严谨，作用强大，对于酒精性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌早中期等肝脏疾病疗效较好。

综上，房氏天灸1号对四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤具有保护作用，联合复方联苯双酯作用更显著，其作用机制可能与增强机体抗氧化能力、抑制炎症因子释放、疏通经络、改善气血运行有关。

3林咸明,陈华德,施军平.穴位天灸结合凉血活血药治疗肝炎后高胆红素血症.中国中西医结合消化杂志,2003,2003(1):43-44.