经方桂枝茯苓丸“异病同治”任脉癥瘕类疾病的网络药理学研究＊

石雅馨，王 新，张乘源，张绪丹，刘 双，王雁飞，师 伟

（1.山东中医药大学中医学院 济南250014；2.山东中医药大学第一临床医学院 济南250014；3.山东中医药大学附属医院 济南250014）

子宫腺肌病（adenomyosis，AMs）是指子宫肌层内出现具有活性的子宫内膜组织（腺体和间质）的一类雌激素依赖性的疾病[1-2]。甲状腺结节（thyroid nodule，TN）是指甲状腺局部细胞异常增生所引起的组织结构团块状病变[3]，一般认为其发病多与碘摄入量、自身免疫因素、激素水平密切相关[4]，且有良恶性之分。乳腺结节（breast nodule，BN）目前为止尚无准确的定义，临床主要分为乳腺良性结节与乳腺恶性肿瘤，多通过超声影像学检测发现[5]。此三种疾病虽分属不同器官的不同疾病，但均受下丘脑-垂体-腺体轴的调控，为内分泌的靶器官。西医发病机制为内分泌紊乱、雌激素水平过高等因素导致腺体局部细胞异常增生而致组织结构紊乱[6-7]。且有研究证明，甲状腺、乳腺、子宫疾病发病过程有明确相关性[8]。目前西医治疗较单一且疗效差强人意，手术治疗是唯一的根治方法。

从中医角度而言，此三种病虽分属“癥瘕”、“乳癖”、“瘿瘤”等不同疾病，其病异而本同也，如《圣济总录》云“癥瘕结癖者，积聚之异名也。证状不一，原其根本，大略相类”。根据经络循行部位及疾病病机特点，可将其归为任脉癥瘕类病。任脉起于胞宫，循腹由下而上贯穿子宫、甲状腺、乳腺各器官。任脉瘀滞，互结于经络，积而成癥，聚而成瘕则易产生癥瘕类疾病。中医辨证论治对此类疾病治疗有较好的成效，故从“异病同治”角度出发，将其归为一类，运用经方桂枝茯苓丸进行论治可为临床提供新思路。

桂枝茯苓丸是《金匮要略》经典名方，有通脉化癥、缓消瘀结的作用。文献研究发现，桂枝茯苓丸可缓解子宫腺肌病患者痛经程度，降低雌激素水平[9]，亦可发挥调节内分泌及雌激素等作用治疗甲状腺结节和乳腺结节[10]。本课题组前期对子宫腺肌病病机与治疗已进行深入挖掘与研究，在临床及实验方面证明桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病的有效性，数据挖掘结果显示，赤芍、桃仁、茯苓在子宫腺肌病治疗中出现频次最高[11]，动物实验中已被证实有治疗效果。且已有研究证明子宫、乳腺、甲状腺发病有明显相关性，为了进一步佐证实验的准确性，拓宽课题研究思路，探索疾病之间共同机制及桂枝茯苓丸在“异病同治”过程中所发挥的分子生物学作用，故进行网络药理学研究，以期为后续实验验证提供初步证据与发掘导向。

1 方法

1.1 桂枝茯苓丸有效作用成分的筛选及靶点的获取

借助中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）对桂枝茯苓丸中5味中药桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁的化学成分进行筛选，并根据成分药物代谢动力学参数进行选择，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和 类 药 性（Drug-Likeness，DL）≥0.18为标准，初步获得有效作用成分及蛋白质靶点。之后通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org）对相关靶点名称进行规范。

1.2 有效成分-疾病共有靶点的获取

在GenCards数据库（https://www.genecards.org）、DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org)、DrugBank（https://www.drugbank.com）数据库中以“adenomyosis”、“thyroid nodule”、“breast nodule”为关键词获取AMs、TN、BN相关疾病靶点，并通过韦恩图获取中药在任脉癥瘕类病“异病同治”过程中的所存在的共有数据库。

1.3 复方网络构建及蛋白互作网络分析

将桂枝茯苓丸方中中药、有效成分、靶点上传至Cytoscape3.7.2，利用Merge功能将其合并，最终绘制成复方网络图。

将有效成分-疾病共有靶点上传至STRING数据库（https://string-db.org/），物种选择为“人类”，下载靶点蛋白互作网络图及蛋白互作网络数据文件，并导入Cytoscape3.7.2进行蛋白质间相互作用分析（Protein-Protein Interaction，PPI）。

1.4 生物学及通路富集分析

运用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库对共有靶点进行基因本体功能富集（Gene Ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics，KEGG）通路富集分析，并对结果根据P值进行排序，以备后续处理。

为了深入研究通路关键靶标在桂枝茯苓丸“异病同治”任脉癥瘕类疾病中发挥的作用，选取通路关键靶 标，通 过BioGPS（http://biogps.org/）、Genecards、DisGENET数据库获取相关组织、亚细胞分布及蛋白归属信息。

1.5 分子对接

选取桂枝茯苓丸中度值（Degree）排名前十的有效成分与Degree值≥中位数的关键靶点。从TCMSP中下载配体的mol2结构，经Autodock Tools处理后，保存为pdbqt结构；从RCSB中获取受体3D结构，经Discovery Studio去除水分子、分离配体、受体后，利用Autodock Tools进行加氢，并计算结合位点，将受体另存为pdbqt文件。通过Autodock Vina进行对接模拟运算（PDB ID及对接相关参数见表1），根据对接后得到的配体-受体最低结合能，构建热图并分析相关结合位点及氨基酸残基相互作用力。

表1 受体蛋白PDB ID及对接相关参数表

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸有效作用成分的筛选及靶点的获取

初步提取，桂枝茯苓丸有效成分共494个，其中桂枝220个，茯苓34个，赤芍119个，牡丹皮55个，桃仁66个。经过筛选后，共获得化合物有效成分85个，相关靶点102个。对有效成分进行归纳梳理发现，常春藤素（hederagenin）为茯苓、桃仁共有活性成分，(+)-儿茶素[(+)-catechin]、谷甾醇（sitosterol）为桂枝、牡丹皮、赤芍的共有活性成分，分布范围广泛，且出现频次较高。预测其可能对任脉癥瘕类病的治疗发挥较大的作用，可对下一步深入细化研究提供方向。

2.2 有效成分-疾病共有靶点的获取

通过对AMs、TN、BN的疾病基因进行检索，分别获得AMs疾病靶点291个，TN靶点2564个，BN靶点2828个，将上述疾病靶点与桂枝茯苓丸102个作用靶点取交集并构建韦恩图，最终获取桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN的共有靶点为24个（图1）。

图1 桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病、甲状腺结节、乳腺结节共有靶点韦恩图

2.3 复方网络构建及蛋白互作网络分

利用Cytoscape3.7.2软件对桂枝茯苓丸5味中药，有效成分及其靶点进行处理，构建桂枝茯苓丸复方网络图（图2）。151个节点通过386条边相连接，其中，蓝色节点代表5味中药，绿色节点代表作用靶点，其余不同颜色代表不同药物的有效成分。可以看出，桂枝茯苓丸有效成分及作用靶点在分子生物学层面存在多层次、多维度交叉对应关系，构成一个复杂网络系统。其中桂枝茯苓丸中关键有效成分黄芩素（baicalein，degree=38）、鞣花酸（ellagic acid，degree=21）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=36）、(+)-儿茶素[(+)-catechin，degree=15]、豆 甾 醇（Stigmasterol，degree=28）等主要通过环加氧酶2（PTGS2，degree=20）、雌激素受体（ESR1，degree=6）等共有关键靶点对AMs、TN、BN发挥“异病同治”作用。

图2 桂枝茯苓丸中药-有效成分-靶点网络图

通过STRING和Cytoscape3.7.2构建共有靶点PPI网络图（图3A）。由24个节点，175条边组成，平均节点度值（average node degree）是14.6，平均中心聚类系数（avg.local clustering coefficient）为0.815，中位 数（median）为17。筛选degree≥17的靶点有12个（图3B），分别为：TP53、AKT1、VEGFA、IL6、MMP9、TNF、PTGS2、MMP2、CXCL8、ESR1、TGFB1、HIF1A。由此分析，这12个靶点为此网络核心靶点，可能在桂枝茯苓丸干预AMs、TN、BN过程中发挥关键作用。

图3 蛋白互作网络图及核心靶点条形图

2.4 生物学及通路富集分析

运用DAVID数据库对共有靶点进行GO富集分析，主要包含生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（MolecularFunction，MF），并按P值进行排序（图4）。结果显示，桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN过程中，主要集中在凋亡过程的正调控、炎症反应、机体免疫反应及平滑肌细胞增殖的正向调节等生物过程中；主要包含细胞、RNA聚合酶II转录因子复合体等细胞组成。此外，转录调控区DNA结合、酶结合、类固醇激素受体活性等分子功能亦参与其中。

图4 桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病、甲状腺结节、乳腺结节GO富集分析

为了研究桂枝茯苓丸在干预AMs、TN、BN过程中通路发挥的关键作用，故进行KEGG分析。结果显示，72条信号通路参与桂枝茯苓丸对任脉癥瘕类疾病的调控中，根据P值大小，选取前20位信号通路进行可视化分析（图5）。结果显示，Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）等与桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN 的过程密切相关。

图5 KEGG信号通路气泡图（TOP20）

2.5 通路关键靶标的获取及其组织分布、亚细胞分布、蛋白归属信息

为了深入挖掘各通路中的关键靶标及相关分布信息，根据P值对其进行排序，保留前6条信号通路，即肿瘤信号通路（Pathways in cancer）、蛋白聚糖肿瘤（Proteoglycans in cancer）信号通路、内分泌抵抗（Endocrine resistance）等信号通路。通过STRING数据库及Cytoscape3.7.2对此6条通路的靶点进行分析，选取度值≥中位数且出现次数≥平均数的靶点为通路关键靶标，共8个（表2）。结果显示，这些靶标可通过调控不同的信号通路对AMs、TN、BN发挥“异病同治”的作用。

表2 通路关键靶标

将上述关键靶标上传至BioGPS数据库获取其在体内组织分布情况，根据基因表达情况保留前5位组织分布信息。利用Cytoscape3.7.2进行分析，获取关键靶标-组织分布信息网络图（图6-A），并按照度值对其进行排序。其中，红色V型代表关键靶标，绿色椭圆形代表组织分布，其中平滑肌（Smooth Muscle，degree=2）、721-B淋巴细胞（721-B-lymphoblasts，degree=3）、CD33+髓细胞（CD33+Myeloid，degree=3）等器官组织在桂枝茯苓丸“异病同治”中意义重大，分析发现，淋巴细胞、CD33+髓细胞度值排名靠前，故推测免疫细胞在提高机体免疫功能，治疗此类疾病中发挥较大作用。此外，子宫（Uterus，degree=1），甲状腺（Thyroid，degree=1）可能作为桂枝茯苓丸治疗过程中的靶器官发挥“异病同治”作用。

通过Gnencards数据库获取其亚细胞分布相关信息，根据其confidence值进行排序，将前五位的亚细胞分布信息上传至Cytoscape3.7.2软件绘制靶标-亚细胞分布信息网络图（图6-B），其中红色V型代表关键靶标，紫色椭圆形代表亚细胞分布信息。结果显示，关键靶标多分布于细胞核（nucleus，degree=8）、内质网（endoplasmic reticulum，degree=5）、细 胞 骨 架（cytoskeleton，degree=5）、线 粒 体（mitochondrion，degree=5）等一系列重要的细胞器中。

图6 关键靶标-组织分布网络图（A）和关键靶标-亚细胞分布网络图（B）

将关键靶标上传至DisGeNET数据库获取其蛋白归属信息（见表3），其主要涉及信号分子（Signaling）、转 录因子（Transcription factor）、激 酶（Kinase）、酶（Enzyme）等。

表3 关键靶标-蛋白归属信息表

2.6 分子对接

为了深入探析桂枝茯苓丸干预AMs、TN、BN关键分子机制，筛选10个有效成分作为配体，12个靶点蛋白作为受体，对接结果如图7所示。横坐标代表桂枝茯苓丸有效成分，纵坐标代表靶点蛋白，颜色深浅代表结合能的大小。结果显示，β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、豆甾醇等10个有效成分与IL-6、AKT1、TP53等12个靶点蛋白对接所得最低结合能均小于-5.0kJ·mol-1,其中，（+）-儿茶素、豆甾醇分别与基质金属蛋白酶9（Matrix Metallo Proteinase 9，MMP9）、趋 化 因 子8（Interleukin-8，CXCL8）结合能力较优。

图7 有效成分与靶点蛋白分子对接最低结合能热图

根据分子对接最低结合能筛选出结合能力较优的前三组蛋白，如图8所示。其中，（+）-儿茶素通过Ala417、Leu397、Glu402、Ala189氨基酸残基形成四条氢键，与MMP9紧密结合（图8A）；豆甾醇通过Glu48氨基酸残基形成1条氢键，β-谷甾醇通过Arg6、Cys7形成2条氢键，二者均与CXCL8结合较紧密（图8B、8C）。由此看来，此三种化合物及两种蛋白可能为桂枝茯苓丸“异病同治”中的关键化合物及核心靶点蛋白，也为进一步实验验证提供了分子生物学基础。

图8 桂枝茯苓丸关键化合物与核心靶点蛋白分子对接图

3 讨论

中医认为，AMs、TN、BN虽分别属于“癥瘕”、“乳癖”、“瘿瘤”等不同疾病，但其病位及病机均有极大关联性与相似性，任脉阻瘀贯穿其发病始终，故在中医学上可将其归纳为任脉癥瘕类病进行“异病同治”研究。古籍记载桂枝茯苓丸多用于妇人癥病的治疗，但其温通经脉，治血兼治水之功，亦可用于经脉不通，任脉瘀阻所导致的癥瘕类病。方中桂枝、茯苓相配温经脉、渗痰湿，桃仁配丹皮，消癥结，凉血瘀，寓通因通用之意，赤芍调营阴，缓急痛，全方共奏通脉化癥、缓消瘀结之功。药理研究表明，桂枝茯苓丸有调节免疫功能及抗炎的功效，其可能与促进肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）的分泌，活化自然杀伤细胞（NK细胞）有关，除此之外，桂枝茯苓丸可降低体内雌激素，具有雌激素样活性[12]。桂枝茯苓配伍可降低血液中前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、TNF-α的含量，提高小鼠胸腺及脾脏重量，提高免疫能力[13]，对任脉癥瘕类病有一定治疗作用。

通过前期对桂枝茯苓丸“异病同治”AMs、TN、BN有效化合物进行筛选并用分子对接技术进行验证，发现（+）-儿茶素、豆甾醇在桂枝茯苓丸中分布范围最广，且分子对接中分别与CXCL8、MMP9结合最紧密，黄芩素、β-谷甾醇degree值较高，提示可能在桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN中发挥较大作用。（+）-儿茶素属于酚类活性物质，可通过多种途径发挥不同药理作用，可与体内雌激素受体结合[14]，从而发挥抗雌激素作用，通过降低体内VEGF生成从而抑制子宫内膜异位病灶的生长[15]。豆甾醇通过增加体内IL-2及γ-干扰素（INF-γ）的含量，活化NK细胞，增强免疫功能，可应用于AMs、TN、BN的治疗[16]。黄芩素为黄酮类化合物，有抗炎、抗肿瘤等作用，可通过PI3K/AKT通路诱导肿瘤细胞凋亡[17]，亦可上调CD4+、CD8+表达而增强机体免疫功能，对于乳腺、甲状腺恶性结节有较好的抑制作用[18]。β-谷甾醇能提高血清IgM和IgB的含量，优化免疫系统，改善甲状腺功能[19]。

桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN过程中主要涉及AKT1、VEGFA、IL6、MMP9、TNF、CXCL8、ESR1、TGFB1等靶点蛋白，与炎症、肿瘤、免疫、雌激素等密切相关，其中CXCL8、MMP9为分子对接中结合最优的活性靶点蛋白。CXCL8作为趋化因子，参与细胞黏附、侵袭过程，通过增加基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）表达和血管生成，促进AMs异位细胞、乳腺癌、甲状腺癌的侵袭迁移[20-22]。MMP9在促进血管生成及病灶黏附过程中发挥重要作用，研究表明[23]，对于子宫内膜异位细胞，桂枝茯苓丸能阻止其血管再生及异位病灶黏附，抑制体内MMP9及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）水平，也可通过旁分泌刺激甲状腺内VEGF受体的增加进而促进血管的生成。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1 or PKB）参与调控细胞增殖侵袭、细胞

分化及组织纤维化的过程，主要通过转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）结合成纤维细胞膜上受体，激活PI3K/Akt通路，进而磷酸化激活AKT因子来完成[24]。已有研究证明[25]，TGF-β1与子宫腺肌病异位病灶纤维化及甲状腺结节、乳腺结节密切相关。雌激素受体α（Estrogen Receptor 1，ESR1）主要发挥调节雌激素的作用，在AMs、TN、BN中表达增高[26]，桂枝茯苓丸通过降低其受体水平，达到抑制乳腺上皮细胞、子宫内膜细胞的增生的作用。本研究对于桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN过程中有效化合物及靶点蛋白进行筛选分析，发现干预过程通过多靶点、多角度发挥作用，由此推测，此三种疾病发病机理及药物作用靶点具有较大一致性，且文献研究发现，部分结果已通过实验研究进行验证，对临床有一定指导作用，但仍有部分基因有待于深入分析研究。

通过GO和KEGG富集分析得知桂枝茯苓丸通过多途径、多通路发挥多种治疗作用。结合分析结果及文献研究发现，桂枝茯苓丸发挥治疗作用与Pathways in cancer、Toll样受体、TNF、雌激素等信号通路关系较密切，其主要涉及肿瘤、炎症因子、免疫调控、雌激素等不同环节。Toll样受体大多存在于机体免疫细胞、上皮细胞表面，通过识别并结合病原微生物等，诱发免疫应答[27]，也参与子AMs、TN、BN发展过程中[28]。TNF信号通路主要参与AMs、TN、BN的免疫、炎症反应的过程[29-31]，文献表明，桂枝茯苓丸分泌TNF-α可促进集落刺激因子及NK细胞的活化，以治疗免疫、内分泌失调所致的任脉癥瘕类疾病[12]。桂枝茯苓丸对于体内雌激素异常所致的此类疾病中具有类雌激素作用[12,32]。为进一步预测桂枝茯苓丸作用的主要组织及器官，通过BioGPS分析发现，共有关键靶点主要存在于平滑肌、淋巴细胞、甲状腺、子宫等组织器官中，这可能与AMs、TN、BN发病过程中炎症免疫反应、平滑肌细胞增殖及组织器官纤维化密切相关。AMs常表现为子宫局部组织纤维化、肌层回声欠均及子宫腺肌瘤。这一过程多由于增生的内膜向肌层侵入，形成内膜-肌层结合带，进而使局部平滑肌细胞增殖而形成[7]，BN形成的过程多有组织纤维化的形成，且缺氧环境可加速胶原纤维的沉积[33]。分析发现，桂枝茯苓丸通过多途径、多通路发挥对AMs、TN、BN的治疗，对进一步分析研究有较深的指导意义，但由于通路筛选是根据所在通路靶点富集数目而定，故筛选的通路及关键靶点仍存在一定的不准确性，其作用机制较为复杂，还需进一步验证。

本课题组前期已通过数据挖掘、药效学研究、多维指纹图谱及动物实验验证桂枝茯苓丸有效成分通过减少VEGF、Caspase-3、Caspase-9、TNF-α等表达从而抑制血管生成、细胞增殖及炎症反应，达到抗子宫腺肌病的目的[11,34]，一定程度佐证了网络药理学的准确性，并为下一步实验提供方向。且基于中医理论及文献研究发现，AMs、TB、BN有极大关联性，故推而广之，试从分子生物学角度进一步探索桂枝茯苓丸对任脉癥瘕类病治疗的机制与靶点，为TN、BN的治疗探索新方向。然而网络药理学由于数据库的不完善性及欠缺相应的基因数据库，其在体内的生物过程及作用通路仍尚不明确，仍需进一步实验研究。但桂枝茯苓丸治疗AMs、TN、BN过程中所筛选的关键靶点、信号通路及分子对接结果与发病机制及目前研究方向较为一致，主要包含炎症反应、免疫调节、雌激素变化等多个过程，也证明了桂枝茯苓丸多成分、多靶点、多通路的治疗作用，为后续进一步实验研究及中医学“异病同治”更深层次的探讨提供了参考。