云南传统腌制韭菜中一株乳酸菌的分离及发酵特性研究

杜永新，李琼莹，尹柯茹，张丽波，郝亚琴，刘雪英，赵世伟，马万平，杨子彪

（云南皇氏来思尔乳业有限公司，云南大理 671003）

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）隶属于原核微生物中的链球菌属，是一种对机体有益的乳酸菌，作为一种工业化发酵剂而被广泛使用；形态多为球形或者卵球形，直径一般小于1 μm，成对或者链状生长，其最适生长温度为38～43 ℃、pH 值6.0～7.0，通常情况下菌体的形态会受到培养基和培养温度的影响[1]；大多数菌株在50 ℃下能够生长，在60 ℃下加热30 min 仍能存活；嗜热链球菌是一种革兰氏阳性菌，其固有特征为无芽孢、无鞭毛、无运动性，属于兼性厌氧同型发酵乳酸菌，能够利用乳糖生成L（+）型乳酸、乙醛和丁二酮，属于化能异养型微生物；其拥有多种蛋白水解酶，但对乳蛋白水解能力较弱，必须从外界吸收多种小分子营养物质才能较好地实现自身的新陈代谢[2]；嗜热链球菌作为乳品生产过程中非常重要的发酵菌株[3]，具有重大的市场价值[4]，是公认安全的食品级微生物，对人体肠道菌群的平衡、乳糖不耐症的改善和机体免疫力的调节具有积极作用[5-6]。

云南腌制韭菜产自云南省大理白族自治州宾川县，由当地自产韭菜、韭花等食材泡制而成，其味道鲜美、酸香味浓郁、色泽鲜艳[7]。腌制韭菜中微生物群落复杂多样，含有丰富的乳酸菌、酵母菌等，而独特的产香性能也与其微生物群落中乳酸菌所产双乙酰等有关。双乙酰亦称双乙酰酮或2,3-丁二酮，是一种重要的食品风味物质[8-9]。双乙酰是很多发酵乳制品如奶油、酪乳、发酵乳、干酪的主要风味物质，在合适浓度时，其可增加发酵乳制品的香味，同时也是啤酒和葡萄酒等的重要异味来源[10]。

试验选取产自云南地区的腌制韭菜，利用传统的微生物分离纯化及分子鉴定技术，对其中的产双乙酰乳酸菌进行分离鉴定，并确定筛选菌株的双乙酰产量，最终筛选出一株生长性能佳、产双乙酰、耐受性良好的优势菌种，旨在为开发风味独特的工艺化乳酸菌发酵剂和新型功能性食品制备提供理论依据及数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

韭菜腌菜，云南大理特色食品厂提供；MC 培养基、M17 培养基，青岛海博生物技术有限公司提供；双乙酰标准品，Sigma 提供；PCR Mix 酶、细菌16S rDNA 通用引物、ddH2O，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；DNA 提取试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；三氯乙酸，江苏强盛功能化学股份有限公司提供；氢氧化钠，天津大茂化学试剂厂提供。

1.1.2 试验仪器

PCR 仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司产品；凝胶成像系统，北京科创锐新生物科技有限公司产品；显微镜；漩涡振荡器，济南欧莱博生物科技有限公司产品；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；SW-CJ-1F 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；卧式高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品中疑似乳酸菌的分离与保藏

吸取1 mL 腌制韭菜汁，采用PBS 对其进行10 倍梯度稀释，选择合适的浓度梯度，吸取1 mL 涂布于M17 固体平板，置于38 ℃培养箱中培养48 h。培养结束后挑选出平板上性状不同的单菌落在M17培养基上进行划线，直至获得纯培养物，然后进行革兰氏染色和接触酶试验。纯化菌株经浓缩后转接于含有10%甘油的M17 液体培养基中冷冻保藏。

1.2.2 菌株的鉴定

（1）形态学观察。将筛选出的疑似乳酸菌菌株培养液划线接种到M17 固体培养基上，恒温38 ℃培养48 h，观察并记下菌落的特征、形态、大小、表面光滑程度，菌面隆起程度、菌落边缘的整齐程度等基本特征。将菌株的纯培养物进行涂片，然后进行革兰氏染色，在显微镜下观察记录其细胞形态特征。

（2）菌株总DNA 提取。乳酸菌基因组总DNA由上海生工公司提供的Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取；1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测后保存在-20 ℃的冰箱中。

（3）16S rRNA 扩增。16S rRNA 扩增的上、下游引物采用的是细菌通用引物。引物序列及扩增目标长度如下。

细菌通用引物序列及扩增片段长度见表1。

表1 细菌通用引物序列及扩增片段长度

按下表反应体积及反应程序进行PCR 扩增目的基因。

PCR 反应体积及反应程序见表2。

表2 PCR 反应体积及反应程序

按照反应体系加样后，轻轻混匀并简短离心，反应结束取5 μL PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并设空白对照。

（4）序列分析。在NCBI 上将GenBank 核酸序列数据库的已知序列和所得序列进行比较，当相似度在98%以上的，可以被认为是同一种。

1.2.3 菌株性能测定

（1）耐受性测定。将活化好的嗜热链球菌C198-B-03 转接至pH 值分别为2.5 的M17 培养液中混匀，于恒温培养箱内38 ℃下静置培养2 h，培养结束测定活菌数；按公式计算存活率；将活化好的嗜热链球菌C198-B-03 转接至胆盐质量分数为0.3%的M17 培养液中混匀，于恒温培养箱内38 ℃下静置培养3 h，培养结束测定活菌数。

（2）奶管中发酵性能测定。将活化后的菌种按2%（V/V）的接种量转接至12%（W/V）脱脂乳管内，于恒温培养箱内38 ℃下静置培养，记录凝乳时间、凝乳时滴定酸度；测定接种后24，48，72，96 h 3 个温度梯度保藏（4 ℃、室温、38 ℃）下的活菌数和滴定酸度，活菌数、滴定酸度测定分别参照GB 4789.35—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验[11]和GB 5009.239-2016 食品安全国家标准 食品酸度的测定[12]所述方法测定。

1.2.4 嗜热链球菌C198-B-03 产双乙酰含量测定

（1）双乙酰标准曲线的建立。取一定量的双乙酞标准品配制成质量浓度分别为0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 mg/L 的双乙酞标准溶液。再取12 支试管分两排放置，分别加入5 mL 上述不同质量浓度的标准溶液各2 支，第一排试管中加入1%的邻苯二胺溶液0.25 mL，第二排试管作为空白组不加，摇匀后置于黑暗处放置30 min。待反应完全，第一排试管加4.0 mol/L 盐酸溶液1.0 mL，第二排试管加4.0 mol/L盐酸溶液1.25 mL，终止反应。混匀后以空白组作为参比液，于波长335 nm 处测定吸光度。以双乙酞质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）发酵乳样品中双乙酰含量的测定。

①取待测发酵乳20 mL，与等体积16%三氯乙酸溶液混匀，静置10 min，于4 ℃下以转速3 500 r/min离心10 min；②离心结束，小心吸出上清液，并用滤纸过滤，保证上清液澄清；③吸取步骤（2）制得的溶液各10 mL 于2 只试管内，分别编号为1 和2，向1 号管内加入1%邻苯二胺溶液0.5 mL，充分混匀，2 号管不加；④将1、2 号管置于暗处避光反应30 min；⑤反应结束后分别向1 号管内加入4 mol/L HCl 溶液1 mL，2 管内加4 mol/L HCl 溶液2.5 mL 混匀终止反应；⑥以2 号管作为参比，利用紫外-可见分光光度计于波长335nm 处测定其OD 值，每个样品重复3 次试验；⑦根据双乙酰标准曲线获得待测样品中双乙酰质量浓度。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 C198-B-03 菌株菌落形态

C198-B-03 菌落生长形态情况见图1，C198-B-03 菌体镜检情况见图2。

图1 C198-B-03 菌落生长形态情况

由图1 可知，C198-3-03 菌落呈圆形、乳白色、不透明，表面有凸起、光滑湿润，边缘整齐，菌落直径大小约为0.1 mm。由图2 可知，经革兰氏染色后在光学显微镜下C198-B-03 菌株为革兰氏阳性（G+），菌体形状呈球形长链状存在，无芽孢、无鞭毛。

图2 C198-B-03 菌体镜检情况

2.1.2 菌株分子生物学鉴定

（1）C198-B-03 菌株16S rRNA 琼脂糖凝胶电泳结果。将初步获得革兰氏阳性（G+）、过氧化氢酶阴性的菌株暂定为乳酸菌，按UNI-Q 柱式细菌DNA抽提试剂盒说明书步骤提取细菌基因组，以细菌16S rRNA 通用引物作为引物，细菌基因组为模板进行PCR 扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。

C198-B-03 PCR 产物凝胶电泳情况见图3。

图3 C198-B-03 PCR 产物凝胶电泳情况

由图3 可知，扩增产物的片段长度为1 500 bp左右，与预期大小一致，图像清晰、无弥散且无杂带，表明PCR 扩增产物质量较高，可用于后续的测序。

（2）C198-B-03 菌株16S rRNA 序列分析。将C198-B-03 菌株的16S rRNA PCR 扩增产物送生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果显示扩增产物序列长度为1 375 bp。将C198-B-03 菌株的16S rRNA 序列与Gen-bank 数据库中的序列进行同源性比较。

C198-B-03 菌株的同源性比较见表3。

表3 C198-B-03 菌株的同源性比较

结果显示，C198-B-03 菌株和嗜热链球菌ST64987、嗜热链球菌PNGR K13 等的同源性相似度最高，达100%，可初步判定C198-B-03 菌株为嗜热链球菌。

（3）C198-B-03 菌株系统发育树。将16S rRNA基因序列在NCBI 上进行BLAST 比对，利用MEGA7.0软件构建系统发育树[13]。由C198-B-03 菌株系统发育树可知，C198-B-03 菌株与Streptococcus thermophilus strain ST64987、Streptococcus thermophilusstrain N4L 等具有较高的亲缘关系，结合形态学特征及基因序列分析结果，可将C198-B-03 菌株确定为嗜热链球菌。

菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系统发育树见图4。

图4 菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系统发育树

2.2 菌株耐受性分析

嗜热链球菌作为益生菌被人和动物食用时，会遇到胃酸环境的胁迫；作为发酵菌株被用于食品工业时，会遇到加工和贮藏环境的酸胁迫；乳酸菌在培养过程中，会遇到自身产酸造成的胁迫；而益生菌在人体内充分发挥其特定的益生功能最重要的一点需要顺利通过胃中酸性环境和十二指肠高胆盐环境，以活菌状态到达小肠和大肠，这样才能发挥益生菌微生态调节的功能，据此在益生菌筛选过程中对酸性环境和胆盐的耐受是益生菌必备的生理特征。一般来说，人体胃酸pH 值为2～3，小肠中的胆盐浓度为3～5 mmol/L，通常研究者以pH 值为2.5，胆盐质量浓度为3 g/L 的培养基介质对菌株进行耐酸耐胆盐能力筛选[14]。通过将筛选的嗜热链球菌C198-B-03在pH 值为2.5 的M17 液体培养基中作用2 h 后其存活率可达50.98%，经胆盐质量分数为0.3%的M17作用3 h 后存活率可达44.11%；即说明筛选得到的嗜热链球菌C198-B-03 具有较优的胆盐耐受性和酸胁迫性，可作为肠道耐受潜在菌株应用，有较大开发价值。

2.3 菌株产双乙酰能力测定

2.3.1 双乙酰标准曲线的绘制

双乙酰标准曲线见图5。

图5 双乙酰标准曲线

由图5 可知，由图可知，采用邻苯二胺比色法测定双乙酰的标准曲线，其线性关系良好。该标准曲线的回归方程为Y=0.079 7X+0.007 9，R2=0.999 7。

2.3.2 试样中双乙酰浓度测定

采用邻苯二胺比色法测定试样OD335值，并参照双乙酰标准曲线计算试样中双乙酰的质量浓度；根据试验结果测得试样OD335值为0.783 0，带入回归方程计算出试样中双乙酰的质量浓度，即嗜热链球菌C198-B-03 在12%脱脂乳中发酵6 h 后其代谢双乙酰含量可达9.725 2 mg/L。

2.4 发酵特性分析

2.4.1 嗜热链球菌C198-B-03 在M17 中的生长曲线

菌株C198-B-03 在M17 中，温度38 ℃发酵的生长曲线。

C198-B-03 在M17 中的生长曲线见图6。

图6 C198-B-03 在M17 中的生长曲线

结果显示，该菌在1 h 后开始进入对数期，其对数期保持至4 h；4 h 后进入稳定期，菌液OD 值保持在1.023 并趋于稳定，一直持续至24 h；在M17液体培养基中38℃培养条件下嗜热链球菌C198-B-03 的最大比生长率为0.38。

式中：dX——单位时间OD 值增量；

dT——单位时间。

2.4.2 嗜热链球菌C198-B-03 在奶管中发酵性能及稳定性测定

将活化后的菌株按2%（V/V）接种于灭菌后的脱脂乳管内，于38 ℃下恒温培养，凝乳后将奶管取出分别置于4 ℃，室温38 ℃条件下保藏或继续培养，并于24，48，72，96 h 后测定样品滴定酸度和活菌数。

嗜热链球菌C198-B-03 发酵奶管在不同条件下滴定酸度变化见图7，嗜热链球菌C198-B-03 发酵奶管在不同条件下活菌数变化见图8。

图7 嗜热链球菌C198-B-03 发酵奶管在不同条件下滴定酸度变化

图8 嗜热链球菌C198-B-03 发酵奶管在不同条件下活菌数变化

结果表明，嗜热链球菌C198-B-03 单菌株发酵12%脱脂乳时具有很快的产酸速度，发酵3 h 开始凝乳，其凝乳时滴定酸度达48°T，黏度7.098 Pa·s；冷藏条件下储藏稳定性测定结果显示，4 ℃条件下96 h 内滴定酸度由60°T 增至86°T，活菌数呈现先上升后下降趋势，并趋于稳定，其活菌数最高可达5.15×108CFU/mL；室温条件下储藏稳定性结果表明，96 h 内滴定酸度由64°T 增至106°T，活菌数随储藏时间增加而呈现下降趋势，室温下96 h 时活菌数为2.2×108CFU/mL。

在乳酸菌发酵过程中，随着产酸量的增加，乳酸菌的生长受到抑制。一般情况下，与保加利亚乳杆菌相比，嗜热链球菌的酸稳定性较弱。因此，在酸性发酵乳中的稳定性是限制嗜热链球菌产酸能力的一个重要因素。在试验中，嗜热链球菌C198-B-03 在38 ℃条件下连续发酵12%脱脂乳96 h 后，极限滴定酸度为120°T，活菌数仍保持在1.5×108CFU/mL，揭示该菌在酸性发酵乳中有较好的稳定性。

3 结论

通过梯度稀释法从腌制韭菜中分离到一株高产双乙酰的嗜热链球菌C198-B-03。在12%脱脂乳中发酵6 h 其代谢双乙酰含量达9.725 2 mg/L；在pH值为2.5 条件下作用2 h 后其存活率为50.98%，在胆盐质量分数为0.3%条件下作用3 h 后存活率为44.11%；在M17 液体培养基中其最大比生长速率为0.38；在12%脱脂乳中产酸速率快，发酵3 h 开始凝乳，于38 ℃条件下发酵72 h 后酸不再上升，发酵96 h 极限滴定酸度为120°T，活菌数仍保持在1.5×108CFU/mL，有较好稳定性；可作为优良的酸奶剂发酵菌株及肠道耐受备用菌株开发。

4 讨论

嗜热链球菌作为干酷、酸奶等发酵乳制品的主要发酵剂，被公认为是仅次于乳酸乳球菌的第二大重要商业化发酵剂供试菌种[15]。酸奶的质量与发酵剂的生长性能、产酸能力、产风味物质能力是直接相关的[16]，用生长速度快、产酸能力强、后酸化低及产风味物质能力强的发酵剂能缩短发酵乳制备周期、提高产品质量并节约成本；双乙酰作为一种羰基化合物被认为是酸奶中关键的风味物质[17-18]，试验从云南大理传统腌制韭菜中分离得到一株产酸速率快、后酸化低、高产双乙酰且对酸和胆盐耐受性较优良的嗜热链球菌，并在发酵乳中有较好的稳定性，可作为功能性发酵剂进一步开发。