海带多糖超声法提取工艺优化及其对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响

吴紫云，王海洁，孙婵婵，贺红军

（烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

海带是世界上养殖最广和消费最多的食用褐藻，素有“海中蔬菜”之称，含有多糖、肽、ω-3 脂肪酸、酚类物质等丰富的生物活性化合物[1]，其营养成分多、药用价值高，我国的海带总产量位居世界第一，海带的养殖业是一个大规模的产业，且海带深受亚洲人民的喜爱[2]。海带多糖为一种硫化多糖，存在于褐藻中，研究表明，其具有抗肿瘤[3]、降血脂[4]、抗病毒[5]、免疫调节[6]等改善人类健康和赋予各种生理功能的潜力。因此，海带多糖已成为开发功能性食品和新型医药产品的重要来源[7]。目前，海带多糖的提取方法有热水浸提法[8]、超声辅助提取法[9]、酶辅助提取法[10]等，但水提法耗能大，且得率低，酶法的生产成本高，酸提法酸度过高容易造成多糖的破坏。

巨噬细胞作为人体自身免疫系统中重要的一部分，其可维持组织形态，且具有监视目标生物体的破坏和趋化性等功能[11]。这些功能的多样性取决于其对炎症信号的差异性反应，如脂多糖和一些γ 干扰素会诱导巨噬细胞，使其产生M1 型极化，释放大量的促炎因子[12]，而白细胞介素刺激巨噬细胞产生M2型极化，使细胞因子得到释放，发生炎症的拮抗作用[13]。因此，激活巨噬细胞为抵抗疾病提供了一个新思路。

以鲜海带为原料，通过超声辅助法对海带多糖进行提取，再通过海带多糖对巨噬细胞的黏附试验、细胞的增殖活力和细胞内NO、ROS 的释放，研究海带多糖对巨噬细胞的炎症反应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带，购于烟台莱山区海鲜市场；95%乙醇、无水乙醇，分析纯，烟台三和化学试剂有限公司提供；碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供；DMEM 培养基粉末、青霉素-链霉素混合溶液（100×双抗），美国GIBCO 公司提供；胎牛血清培养基，浙江天杭生物科技有限公司提供；胰蛋白酶粉末、MTT 检测试剂盒，北京biodee 公司提供；NO 检测试剂盒，上海Beyotime 公司提供；二甲基亚砜、DCFH-DA，美国Sigma 公司提供。

1.2 仪器与设备

101-3 型电热鼓风干燥箱，龙口市先科仪器公司产品；JM-05D-40 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；GTR16-2 型高速台式冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司产品；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品；DU800 型可见分光光度计，美国Beckman 公司产品；LGJ-10 型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司产品；Olympus IX 50 型倒置相差显微镜香港，MOTIC 公司产品；Thermo 3111 型CO2细胞培养箱，日本三洋电器集团产品；MS-TS 型电子分析天平，福州华志科技有限公司产品；LS-750 型液氮罐，泰来华顿公司产品；SW-CJ-1F 型生物超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；MH-2 型微孔板孵育振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；多功能酶标仪，Molecular Device 公司产品；流式细胞仪，杭州艾森公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 超声辅助法提取海带粗多糖的单因素试验

称取2 g 海带粉末放入锥形瓶中，按照比例加入去离子水，放入超声波中处理30 min，其中分别以料液比（1∶40～1∶80）、超声温度（40～80 ℃）、超声功率（60～100 W）和提取次数（1～5 次）为变量。以转速8 000 r/min 离心10 min，分离得到上清液。将海带残渣以相同的料液比继续加入去离子水，重复以上步骤若干次。将上清液浓缩至一定体积，加入4 倍体积的无水乙醇。在4 ℃的温度下醇沉12 h，离心，取其沉淀冷冻干燥，获得粗多糖。

1.3.2 海带多糖提取的响应面优化

以单因素试验的结果为基础，选择料液比、温度和超声功率为变量，进行三因素三水平的响应面试验。

响应面试验设计因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平设计

1.3.3 海带多糖对巨噬细胞的影响

采用邢丽[14]的方法，观察不同组别不同视野中的细胞贴壁情况。采用MTT 法[15]测定海带多糖对巨噬细胞增殖活力的影响。参考张云超等人[16]的方法，建立LPS 脂多糖模型，参考唐赫鹏等人[17]的方法，分别测定建立和不建立LPS 脂多糖模型细胞内NO 的释放量。采用DCFH-DA 法[18]测定海带多糖对巨噬细胞内活性氧释放的影响。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取法提取海带多糖的结果分析

2.1.1 变量因素对海带多糖提取率的影响

变量因素对海带多糖提取率的影响见图1。

由图1（a）可知，当超声功率为80 W，提取次数为3 次，料液比为1∶60 时，随着提取温度的升高，海带多糖的提取率先升高，再缓慢下降。当提取温度为70 ℃时，海带多糖的提取率达到最高。因此，选择60，70，80 ℃进行后续响应面试验。

由图1（b）可知，当温度为70 ℃，提取次数为3 次，超声功率为80 W 时，随着料液比的增大，多糖得率先升高再缓慢下降。当料液比为1∶60 时，多糖的提取率达到最高。因此，选择料液比为1∶50，1∶60，1∶70 进行后续响应面试验。

图1 变量因素对海带多糖提取率的影响

由图1（c）可知，当温度为70 ℃，提取次数为3 次，料液比为1∶60 时，随着超声功率的增大，海带多糖的提取率先升高再下降。当超声功率为90 W时，多糖的提取率达到最高。因此，选择超声功率80，90，100 W 进行后续响应面试验。

由图1（d）可知，当超声功率为80 W，提取温度为70 ℃，料液比为1∶60 时，随着提取次数的升高，海带多糖的提取率随之升高。当提取次数为3～5 次时，提取率的增加幅度很小，对海带多糖提取率的作用效果不明显，且提高了成本。因此，选择提取次数为3 次。

2.1.2 响应面法优化海带多糖的提取工艺

（1）响应面试验方案及结果。以料液比、温度和超声功率为响应变量，海带多糖得率为响应值，进行响应面试验（见表2），对表2 数据进行二次回归拟合，建立工艺参数回归模型。该模型的回归方程为：

Box-behnken 试验设计及结果见表2。

表2 Box-behnken 试验设计及结果

表3 为超声法提取海带多糖响应面模型的方差分析，响应面模型中p 值的大小决定了该模型是否显著，p 值越小，该模型越显著[19]。由表3 可知，该模型的p 值小于0.001，说明该模型达到极显著性水平。从一次项的偏回归系数可以得出，料液比对海带多糖得率达到极显著水平，提取温度和超声功率对海带多糖的得率具有显著性水平。从交互项可以看出，提取温度和料液比之间的交互作用对海带多糖提取率具有显著性水平，提取温度和超声功率与料液比和超声功率之间的交互作用对海带多糖的得率均不具有显著性。F 值可以判断各因素对海带多糖提取率的影响[19]。F 值的大小为料液比>超声功率>提取温度，即料液比对海带多糖得率的影响最大，其次为超声功率，最后是提取温度。该模型失拟度的p 值为0.058 1（>0.05），说明模型的拟合度比较好，可用于讨论多糖的真实提取率。

回归模型方差分析见表3，方程相关系数见表4。

表3 回归模型方差分析

由表4 可知，该模型的决定系数为0.984 6，模型的校正决定系数为0.964 8，模型的变异系数为3.55%，进一步说明了该模型的可靠性好。综上得知回归方程的拟合性比较高，可用于多糖提取率的预测。

表4 方程相关系数

（2）响应面及等高线分析。通过软件绘制提取率与试验因素的响应面及等高线分析图，其中响应面图中的纵坐标为海带多糖的提取率，横坐标分别为影响海带多糖得率的试验因素。

变量因素对海带多糖得率交互影响的响应面图见图2。

图2 变量因素对海带多糖得率交互影响的响应面图

图2 为两个交互因素对多糖得率的影响，可知交互项对多糖得率的影响作用大小为AB>AC>BC，与表3 的结果一致。采用响应面软件对二次多元回归方程求解，得知料液比、提取温度和超声功率的最适组合为料液比1∶63.72（mg∶mL），提取温度67.73 ℃，超声功率88.81 W，此时海带多糖得率最高，达到17.88%。为了验证试验模型的有效性，考虑到实际情况将最佳工艺条件修正为料液比为1∶64（mg∶mL），提取温度为68 ℃，超声功率为89 W。在此工艺条件下，进行验证试验，发现海带多糖的得率为17.73%，与预测值无显著性差异。以上结果说明，该模型可以较好地预测海带多糖的提取率。

目前，国内外大量学者对海带多糖的提取工艺进行了探究。杨晓雪[20]采用复合酶法与水提法结合提取褐藻糖胶，通过正交试验优化可知，当复合酶比例关系为果胶酶∶α -淀粉酶∶酸性蛋白酶∶纤维素酶∶木聚糖酶的比为11∶1∶5∶18∶11，复合酶添加量为480 U/g，酶解温度为59 ℃，pH 值为4.5，提取时间为10 h，料液比为1∶30（g∶mL）时，此时褐藻多糖的得率为12.04%。Lu J H 等人[21]采用柠檬酸法提取多糖，得知最佳条件为pH 值2，温度120 ℃，时间3 h，此时多糖得率为13.31±0.08%。试验采用超声辅助提取，得率显著性高于其他提取工艺。

2.2 海带多糖对巨噬细胞的影响

2.2.1 海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞贴壁能力的影响

海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞的贴壁能力的影响见图3，不同质量浓度海带多糖对巨噬细胞增殖活力的影响见图4。

图3 海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞的贴壁能力的影响

图4 不同质量浓度海带多糖对巨噬细胞增殖活力的影响

由图3 可知，RAW264.7 巨噬细胞经不同质量浓度的海带多糖处理后，其黏附作用没有很大变化。与对照组相比，加入海带多糖后，巨噬细胞由原来的圆形或者椭圆形分化为典型的梭状，并呈现出一定的浓度依赖性。

通过MTT 法检测海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞活力的影响。试验中，对海带多糖设置了质量浓度梯度，分别为50，100，200，300，400，500 μg/mL，每个浓度设置4 个重复。药物质量浓度处理细胞24 h 后，采用酶标仪在570 nm 处读取吸收值。由图4 可知，海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞活力没有明显的抑制作用。Ji Young Lee 等人[22]研究发现加入海带多糖之后对巨噬细胞的活力没有明显的抑制作用，说明海带多糖对巨噬细胞没有毒性，与试验结果一致。

2.2.2 海带多糖对RAW264.7 巨噬细胞NO、ROS释放量的影响

不同质量浓度海带多糖对建立LPS 脂多糖模型NO 释放量和巨噬细胞NO 和ROS 释放量的影响见图5。

由图5（a）可知，相对于模型（LPS）组，LPS与海带多糖复合组中NO 的释放量随着海带多糖质量浓度的升高也升高，且当海带多糖质量浓度为500 μg/mL 时，其NO 的释放量高于模型组的释放量。由图5（b）可知，加入不同浓度的海带多糖会导致RAW264.7 巨噬细胞NO 释放量呈依赖性增加。对照组中NO 的释放量为2.34 μmol/L，当海带多糖质量浓度为500 μg/mL 时，NO 的释放量达到16.75 μmol/L，为对照组的7.16 倍，说明海带多糖可显著提高巨噬细胞对NO 的释放。

图5 不同质量浓度海带多糖对建立LPS 脂多糖模型NO释放量和巨噬细胞NO 和ROS 释放量的影响

NO 是机体中不可或缺的生物活性分子，是非特异性宿主用来防御肿瘤和防止微生物入侵的重要活性物质[23]。NO 在溶液中极易氧化成NO22-和NO33-，NO33-可通过镉被还原为NO22-，在碱性条件下，NO22-和磺胺作用生成重氮盐，与N-1-奈基乙二胺盐酸进行偶联反应，生成有颜色的化合物，从而可以确定NO 的含量。余玲等人[24]研究发现，添加雷公藤红素与吲哚美辛会显著降低LPS 模型中NO 的释放，说明其具有较好的抗炎效果，与试验结果相反，说明海带多糖对巨噬细胞不产生抗炎作用。

由图5（c）和图5（d）可知，与对照组相比，加入不同质量浓度的海带多糖会导致RAW264.7 巨噬细胞总ROS 水平浓度依赖性的增加，其中海带多糖质量浓度为500 μg/mL 时，ROS 释放量达到最多。CFH-DA 本身没有荧光，是非标记性的氧化敏感的荧光探针，其可以自由穿入细胞膜，当DCFH-DA进入细胞后，会被酯酶进行水解，水解成为DCFH，但是DCFH 却不能穿过细胞膜，因此可以把探针装到细胞内。且细胞内的ROS 可以使不含荧光的DCFH 转化为含有荧光的DCF，从而可以检测出ROS 的释放量。Schepetkin I A 等人[25]的试验表明，植物多糖可增强巨噬细胞的吞噬、分泌活性，诱导其释放NO 和ROS 等炎症因子。Yon-Suk K 等人[23]和Cheng F 等人[26]的研究表明，多糖可促使MAPKs 和NF-κB 通路的相关蛋白发生磷酸化，从而活化MAPKs 和NF-κB 的通路，进而使细胞分泌NO。当有害物质入侵时，会激活免疫反应，释放ROS 等炎症因子[27]。

当巨噬细胞当受到外界的一些刺激时，会分化为促炎亚型（M1 巨噬细胞），或抗炎和组织修复亚型（M2 巨噬细胞），把这种分化的现象叫交替激活。M1 和M2 细胞在细胞表面受体、细胞和趋化因子的分布不同，并在炎症反应中的效应作用相反[28]。当细胞受到一定的刺激时，M1 巨噬细胞表现出促炎作用、释放NO 和ROS 及增强微生物和杀瘤活性。与此相反，M2 巨噬细胞则表现出免疫抑制活性。在试验中，将海带多糖作用于细胞，发现其可促使细胞释放NO 和ROS。这可能是因为添加海带多糖对巨噬细胞产生一定的刺激，分化为M1 巨噬细胞，从而使NO、ROS 的释放量增大。因此，推测海带多糖可以活化巨噬细胞，使其分化为M1 巨噬细胞，从而产生促炎的作用。

3 结论

通过超声辅助法提取海带多糖，采用响应面试验得到最优条件为料液比1∶64（mg∶mL），提取温度68 ℃，超声功率89 W，在此工艺条件下，海带多糖的得率为17.73%。将最优条件下提取的海带多糖用于巨噬细胞的培养，结果表明海带多糖对巨噬细胞无黏附作用。由原来的圆形或者椭圆形分化为典型的梭状，且会出现一定程度的浓度依赖性。通过海带多糖的刺激，可以使巨噬细胞显著释放炎症因子NO 和ROS。因此，可推测海带多糖可以活化巨噬细胞，使其分化为M1 巨噬细胞，从而产生促炎的作用。