ICP-MS结合化学计量学分析不同来源陈皮中38个无机元素△

彭政，郭秀芝，周利，吴统选，王升，康传志，万修福，郭兰萍，张燕*，杨健*

1.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；

2.中国中医科学院 健康研究院，江西 南昌 330000；

3.天圣制药集团股份有限公司，重庆 401120

无机元素是植物中普遍存在的一类成分，其种类及含量不仅是植物遗传特征的体现，也与不同栽培地区的环境因素和种植条件等有很大的关联[1]。同样，无机元素对中药的生长及其在人体内的消化吸收、药理作用的发挥有密切的关系。如Zn 元素可能与当归、红花、艾叶的活血、补血和止血功能有一定的联系[2]；Mg 元素对重楼中的酶有激活作用[3]。对甘草中的无机元素进行研究发现，其有效成分甘草酸和甘草苷的含量与无机元素密切相关，种植甘草时可以通过调控微量元素施用种类和浓度，达到调控药材有效成分的目的[4]。

陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为“广陈皮”和“陈皮”，具有理气健脾、燥湿化痰的功效[5]，用于治疗脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。陈皮作为药食两用的中药材，其元素含量必须在规定的药品和食品中重金属限度标准内[6]。研究发现，陈皮中含有多种无机元素，加工制品陈皮中的Zn、Fe元素较鲜陈皮中的高，而Ca、K、Fe、Mg、Zn元素比陈皮果肉中的含量高[7-9]。

中药材中无机元素测定方法包括原子吸收光谱法（AAS）、原子发射光谱法（AES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等。传统的元素检测方法如石墨炉AAS 虽然准确度较高，但只能单次进样并且测定的元素种类有限，耗时且成本较高。AES 可以同时测定多种元素，但其灵敏度低的缺点使其不能分析某些痕量元素，可以用于元素含量的分析但不能进行元素形态的分析。ICP-MS 因其可以同时测定多种差异较大的元素，且准确性好、精密度高、检测限低，而被广泛应用于中药材无机元素测定[10-11]。化学计量学是一门通过统计学或数学方法建立化学体系测量值与体系状态之间联系的学科，能将实验中产生的海量数据进行提取分析，为中药的复杂性和多样性的分析提供切实的技术支持[12]。

本研究收集了6 个不同来源的陈皮，应用ICPMS 测定其中38 个无机元素含量，采用主成分分析（PCA）和神经网络建模对数据进行进一步的分析，探讨是否能通过元素对不同来源陈皮进行鉴别和区分，以期为陈皮的质量控制及资源开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ICAP-Q 型电感耦合等离子体质谱仪（赛默飞公司）；MM 400 型混合球磨仪（Retsch 公司）；AUW120D 型电子天平（岛津公司）；Millipore Mill-Q型超纯水机（Millipore 公司）；DST-1000 型酸纯化器（Savillex公司）；Mars 6型微波消解仪（CEM公司）。

1.2 试药

38 个元素标准品溶液由Muti-element Solution 1（批号：CL11-60YPY）和Muti-element Solution 2（批号：CL20-54YPY）混合标准品溶液配制而成（SPEX CertiPerp 公司）；硝酸（分析纯，默克公司，由酸纯化器二次纯化）；过氧化氢溶液（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；水为经Millipore Milli-Q水处理系统处理后的去离子水。

陈皮药材分别收集于四川、广东、安徽、广西、江西、重庆6 个省或直辖市，共36 批，见表1。所有样品经中国中医科学院中药资源中心杨健副研究员鉴定均为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。样品经球磨仪打粉后过60目筛，在干燥条件下贮存备用。

表1 陈皮样品信息

2 方法与结果

2.1 ICP-MS条件

射频功率：15 500 W；采样深度：5.0 mm；辅助气和载气（均为氩气）流速分别为0.80、1.05 L·min-1；冷气流流速：14.0 L·min-1；雾化器类型：同心雾化器；雾化室温度：2 ℃；扫描方式：STD 模式；采集点数：3；重复次数：3次。

2.2 混合标准品储备溶液的配制

精密量取标准品溶液适量，用2%硝酸溶液稀释，制成各元素质量浓度均为10 μg·mL-1的混合标准品储备溶液，4 ℃贮存备用。内标溶液为稀释1000倍的Rh溶液（质量浓度为10 μg·mL-1）。

2.3 供试品溶液制备

精密称取陈皮粉末0.1 g置于消解罐中，加入过氧化氢溶液1 mL和硝酸5 mL，将消解罐密闭，用微波消解仪消解，消解程序见表2。消解完全后冷却至室温，冷却完全后将消解罐放在电热板上180 ℃赶酸至剩余1 mL，冷却至室温，转移至10 mL量瓶，超纯水定容，摇匀，过0.4 μm 滤膜，得无机元素供试品溶液。精密量取上述供试品溶液1 mL转移至10 mL或50 mL量瓶中，用超纯水定容，摇匀，过0.45 μm滤膜，得Na、Al、Fe、Zn 元素和Mg、K、Ca 等其他元素供试品溶液。按相同方法制备空白对照溶液。

表2 陈皮样品微波消解程序

2.4 线性关系考察

分别精密量取混合标准品储备溶液适量，加2%硝酸溶液稀释，分别配成含Mg、K、Ca质量浓度为20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1，含Na、Al、Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Rb、Sr、Ba、Cu质量浓度为1、2、5、10、50、100、200、500 ng·mL-1，含Li、Be、V、Co、Ga、Se、Y、Cs、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tl、Th、Ag、Cd、Hg、Pb 质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng·mL-1的系列混合标准品溶液，以计数比率为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。稀释标准品溶液至信噪比（S/N）为3，此时各元素的质量浓度即为该元素的检测限（LOD）。结果显示，各元素的标准曲线线性关系相关系数（r）均在0.99 以上，线性关系良好。标准曲线见表3。

表3 陈皮中38个元素的标准曲线及线性范围

2.5 精密度考察

精密称取同一份混合对照品溶液，按2.1 项下条件连续进样6 次。结果显示，各元素质量分数的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察

取一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h 按2.1 项下条件进行测定。结果显示，不同时间点各元素质量分数的RSD均小于5.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性考察

称取同一批陈皮样品粉末6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件进样测定。结果显示，各元素质量分数的RSD 为1.98%～9.65%，在痕量分析的要求下重复性良好，满足测定要求。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知各元素含量的陈皮粉末样品0.1 g，共3份，分别加入2.2项下各元素标准品储备溶液适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进行测定，记录各元素的响应信号值。结果显示，各元素的平均加样回收率为87.5%～118.3%，RSD均小于13%，表明在痕量分析的要求下，各元素回收率良好，该方法有效可行。

2.9 样品含量测定

分别精密称取36 批不同来源的陈皮样品，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件进样测定，各样品元素含量的测定结果见表4～6。

表4 不同来源陈皮样品中Li等13个无机元素含量测定结果（n=3）

陈皮样品中，K 元素平均质量分数最高，达到8 509.26 mg·kg-1；其次为Ca元素，为3 480.20 mg·kg-1；Mg 和Fe 元素的平均质量分数分别为610.93、145.35 mg·kg-1。而上述4 种元素变异系数最大的是Fe 元素，达到45.67%，表明不同来源陈皮中Fe 元素含量变异程度最大，其平均质量分数为17.42～304.10 mg·kg-1；其余变异系数均较小，Ca 元素变异系数为25.81%，其平均质量分数为1 249.99～6 423.41 mg·kg-1；Mg 元素变异系数为25.71%，其平均质量分数为321.11～857.18 mg·kg-1；K 元素变异系数为25.48%，其平均质量分数为4 927.31～14 049.42 mg·kg-1。Be、Eu、Dy、Ho 和Er 元素平均质量分数较低，均小于0.01 mg·kg-1，部分或大部分批次未检出。经过检测，各批次陈皮样品中的Cd 质量分数较低，均在1 mg·kg-1以下，Pb 元素质量分数均未超过3 mg·kg-1，3 个重金属元素均在《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版限定范围之内。而按照《中国药典》2020 年版限定的Hg 元素质量分数≤0.2 mg·kg-1、Cu元素质量分数≤20 mg·kg-1，36 批陈皮样品中Hg 质量分数均超标，超标率为100%，而Cu 质量分数有2 批样品超标，为广东新会（CP-21、CP-22）样品，超标率为5.56%。即使是按照较为宽松的《美国药典》限量标准，大部分陈皮样品的Hg元素质量分数也超标严重，超标率达到94.44%，而Cu 元素质量分数均未超标。

2.10 陈皮无机元素间的相关性分析

陈皮各元素间存在一定的相关性，结果表明，陈皮中38个元素质量分数之间有193个呈极显著正相关（P＜0.01），62 个呈显著正相关（P＜0.05），2 个呈显著负相关（P＜0.05），而不同来源陈皮无机元素间未出现极显著负相关。

2.11 PCA

对不同来源陈皮的无机元素进行PCA，得到PCA特征值和贡献率（表7）和因子载荷矩阵（表8）。主成分1 与Y、Pr、Nd、Gd、Dy 和Er 元素呈高度正相关，主成分2 与Mg 元素呈较高正相关，主成分3 与K元素呈较高正相关，又因为这3个主成分的总方差贡献率达到了60%，所以可以认为Y、Pr、Nd、Gd、Dy、Er、Mg和K元素是陈皮的特征元素。

表7 陈皮无机元素PCA主成分的特征值及贡献率

表8 陈皮无机元素PCA成分因子载荷矩阵

2.12 神经网络建模

6 个来源共36 批样品随机分成训练集和检验集，训练集24 个，检验集12 个。将6 个不同来源的陈皮依次赋予1～6作为模型的输出，分别为安徽亳州、广西玉林、四川荷花池、江西樟树、广东新会和重庆云阳。首先将原始无机元素数据进行Z-score 标准化处理，用标准化之后的数据代替原始的38 个元素数据作为神经网络单元的输入，然后建立1个3层的陈皮来源BP（back propagation）神经网络模型。神经网络模型的网络输入层节点为38，隐藏层节点数为16，传递函数为Tanh（双曲正切函数），输出层节点数为6，传递函数为归一化指数函数Softmax，该模型训练集预测概率为100%，检验集预测概率为91.7%。BP神经网络对12 批样品检验集的预测结果见表9。

表9 BP神经网络对陈皮12个样品检验集的预测结果

表5 不同来源陈皮样品中Se等13个无机元素含量测定结果（n=3）

表6 不同来源陈皮样品中Y等12个无机元素含量测定结果（n=3）

3 讨论

无机元素是植物生理代谢活动的重要参与者，也是植物次生代谢产物的构成因子，含量和种类的差异会对中药材的药效产生一定的影响[2]。韩丽琴等[13]通过对治疗呼吸系统疾病中药（如鱼腥草、五味子、紫草、甘草、何首乌等）中Fe 元素和总黄酮的定量测定，发现治疗呼吸系统疾病的中药材均含有丰富的Fe 元素和黄酮类化合物。因杰秀等[14]研究58 味归心经中药材时发现，K 元素与Na 元素的平均含量之间存在显著的负相关性，与现代医学用药遵循“高钾低钠”摄入的服用原则相吻合，是归心经中药中无机元素的含量特征之一，证实了传统的归心经中药在选药、用药上的科学性，因此，无机元素应是中药品质评价的重要指标之一。中药材无机元素的含量会受到产地、气候、采收时间、加工方法等一系列因素的影响[10]，不但影响药效的发挥，也给中药的质量控制带来困难。本研究建立了ICP-MS测定陈皮中K、Ca 等38 个无机元素含量的方法，分析发现测定的38个元素中K、Ca、Mg和Fe这4种元素平均质量分数最高，分别为8 509.26、3 480.20、610.93、145.35 mg·kg-1，而Be、Eu、Dy、Ho 和Er等元素平均质量分数较低，均小于0.01 mg·kg-1，部分批次未检出。利用化学计量学对不同来源的陈皮样品进行统计分析，PCA 表明，Y、Pr、Nd、Gd、Dy、Er、Mg 和K 是陈皮的特征元素；而建立的BP神经网络模型可以很好地区分不同来源的陈皮样品，训练集样品正确率为100%，检验集正确率为91.7%。该方法快速、准确，结果可靠，可为陈皮药材的质量控制、品种选育综合利用提供参考。