BMP2与BMP4的基因多态性与难治性根尖周炎风险的相关性

热孜亚·艾尼 马依热·阿布都赛麦提 陈晓涛

根尖周持续感染(persistent apical peridodontitis，PAP)作为慢性根尖周炎的一种临床表现形式，虽然微生物的存在是PAP 发生的始动因子[1,2]，但在过去研究中，已经表明遗传多态性与炎症和细胞活化相关分子的表达差异有关，故基因影响可有助于解释多种疾病的易感[3,4]。且既往研究中证实[5,6]，RANKL、RANK、MMP1、MMP3 等基因的遗传多态性可影响RAP的进展和治疗反应。微生物代谢产物及其相关毒力因子诱导成骨细胞凋亡，造成骨细胞与破骨细胞动态平衡紊乱，影响RANKL、RANK、MMP1的等基因表达，不利于骨吸收和再生修复。考虑到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4 可通过对破骨细胞相关因子的产生或强化作用而抑制破骨细胞分化过程，故本研究对BMP4 基因rs17563 位点、BMP2 基因rs1005464 和rs235768 位点基因型多态性与RAP的相关性进行探讨，现报道如下。

1.资料及方法

1.1 一般资料 选取我院2018 年6 月至2020年8 月期间62 例根尖性牙周炎病变治疗失败需行显微根尖外科手术治疗的患者作为RAP组，RAP纳入标准：(1)符合《牙体牙髓病学》中[7]关于RAP诊断标准；(2)患牙有根管治疗史；(3)有窦道或窦道治疗后未消失；(4)上前牙X 线片显示根尖暗影最大直径超过10mm。排除标准：(1)近期使用过全身抗生素治疗者；(2)合并全身性疾病不耐受手术者；(3)存在根管侧穿；(4)重度牙周病、牙根出现纵折。选取同期根尖性牙周炎病变治疗后根部充实且根尖周围健康的98 例作为对照组。医院伦理委员会已批准本研究，患者及家属签署同意书。两组一般资料(性别、年龄、是否吸烟等)对比P＞0.05，见表1。

表1 两组一般资料比较(，n%)

1.2 方法

1.2.1 标本采集 收集所有试验患者血液标本，采取1.5ml 静脉血，加EDTA 二钠抗凝，提取白细胞基因组DNA(以改良碘化钠法)，其余置于医用冰箱(-80℃)保存备用。

1.2.2 BMP4、BMP2 基因多态性位点检测(1)引物：由上海生物工程技术服务有限公司合成根据BMP4 基因(rs17563)、BMP2 基因(rs1005464、rs235768)的多态性设计序列特异性引物，所用引物详见表2。(2)实时聚合酶链反应条件：所有基因PCR 反应体系体积20μL，DNA 模板量1μg，上、下游引物浓度均为1poml，10μL2×PCR 缓冲液，0.5μl dNTP，耐热DNA 聚合酶和双蒸水分别为0.5μl、18.5μl。(3)循环条件：①BMP4(rs17563 位点)：预变性2 min94℃，25 个循环，三步法(94℃、55℃、72℃分别为20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min，25℃反应终止；②BMP2(rs1005464 和rs235768 位点)：预变性90s94℃，25 个循环，三步法(94℃、55℃、72℃分别为20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min；(4)PCR 产物电泳：于琼脂糖凝胶(2%)将4μL 反应产物上样，选择适当恒压，在缓冲液中以80V，20min 进行电泳，并对BMP4、BMP2 基因位点的基因型及等位基因频率进行判读。

1.3 观察指标 比较两组BMP4、BMP2 基因位点基因型及等位基因频率，并采用逻辑回归其与RAP 发生的相关性。

1.4 数据分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料用(n%)表示，采用χ2检验；计量资料以()表示，采用独立样本t 检验；采用Logistic 进行相关性分析，P＜0.05 差异有统计学意义。

2.结果

2.1 两组BMP2 基因rs235768、rs1005464 位点基因型及等位基因比较 RAP 组rs235768 TT基因型频率、rs235768 等位基因频率中TT 高于对照组(P＜0.05)，两组rs235768、rs1005464 位点基因型及等位基因比较(P＞0.05)，见表3、表4。

表3 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位点基因型及等位基因比较(n%)

表4 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位点基因型及等位基因比较(n%)

2.2 两组BMP4 基因rs17563 位点基因型及等位基因对比 RAP 组C 基因型74.19%及频率66.13%较对照组48.98%、37.24%高(P＜0.05)，见表5。

表5 两组BMP4 基因rs17563 位点基因型及等位基因对比(n%)

2.3 两组BMP4 基因rs17563 位点基因型及等位基因对比 两组BMP4 基因rs17563 位点基因型频率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，C 基因型频率显著高于对照组(P＜0.05)，且C 等位基因频率显著高于对照组(P＜0.05)，见表6。

表6 两组BMP4 基因rs17563 位点基因型及等位基因对比(n%)

2.4 BMP4、BMP2 基因多态性与RAP的相关性分析 BMP2 基因rs235768 基因位点TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)和BMP4基因rs17563 位点CT 基因型及TT 基因型(OR=0.319，95%CI0.132～0.769；OR=0.196，95%CI0.087～0.444)分别是RAP 发生的保护因素和危险因素，见表7。

表7 BMP4、BMP2 基因多态性与RAP的相关性分析

3.讨论

根管治疗联合显微根尖外科手术是治疗RAP的有效手段，但手术疗效受牙龈切除，去骨，机体免疫，牙齿本身条件等因素限制，故探求RAP病因，根据病因选择合理的治疗方案十分必要。RAP 表现为复发性根尖周脓肿和进行性骨质破坏，可导致牙槽骨缺损和牙齿丧失，是以淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等组成的炎性浸润为主要特征，这些细胞可通过释放促炎细胞因子来协助骨修复过程[8-9]。而骨修复通常由防御机制和病原体之间和/ 或牙髓治疗后的自发平衡启动，且涉及多个因素参与。BMP 为参与该过程的重要因子，从氨基酸序列上看，BMP 隶属于转化生长因子-β(TGF-β)家族，BMP2、BMP4 为BMP 中诱导成骨活性最强的因子，可促进牙槽骨、牙骨质和牙周韧带的再生，由于BMP2、BMP4 在骨生物学中具有重要作用[10]，其可能参与RAP发生，故探讨BMP2与BMP4的基因多态性与RAP 风险的相关性可为该疾病的治疗提供一定理论依据。

BMP2 基因定位于20p12，属于疏水性蛋白，主要由前体蛋白、信号肽和成熟结构域组成，参与成骨性细胞分化、基质合成与分泌。BMP2 作为影响骨组织形成的局部生长因子，可在骨形成早期，能募集未分化间质细胞，向骨系细胞分化；还可通过增强成骨细胞内的下游信号分子Smadl/ 5 和表基因Runx2的表达促使骨形成。Kang[11]、Jian[12]将含有rhBMP-2 基因的噬菌体转染人牙周膜成纤维细胞，在牙周膜干细胞的成骨细胞分化过程中，BMP2 具有一定调节作用。在骨吸收过程中，BMP2可能通过RANK、OPG 等系统干扰破骨细胞前体分化；Malik[13]表明Bmp2 在成牙本质细胞组织中的作用，可为定向和组织化的牙齿矿化提供充足时间。本研究中，RAP 组TT 基因型45.16%、T 等位基因频率63.71%均较对照组21.43%、57.14%高，Logistic 分析显示，BMP2 基因rs235768 基因位点TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)是RAP危险因素，提示BMP2 基因rs235768C/ T多态性可能为RAP 发生的危险因素。BMP2 基因rs235768 位点携带T 等位基因会影响牙槽骨的吸收，这在既往已研究中得到证实[14]；Mitra 指出BMP2 rs235768 A＞T 可影响颌面、牙胚发育[15]；Dds ECK[16]等证实携带rs235768(BMP2)TT 基因型(双丝氨酸突变体)持续性根尖周炎者患巴氏杆菌的风险是CC 基因型4 倍以上。这也在一定程度上说明BMP2 基因rs235768 多态性极大地增加RAP发生风险。

BMP4与BMP2 同属于BMP 家族，与BMP2不同的是该基因定位于染色体14q22-q23，可通过对细胞增殖、分化等过程进行调节以控制成骨、破骨细胞，促进骨发育，且参与上颌突发育成上唇和继发腭的过程。Bahrami 等[17]指出，BMP4 rs17563多态性可能是中国人和巴西人发展NSCLP的危险因素；Hao[18]的研究中rsl7563 位点CC 基因型是TT 基因型发生唇腭裂危险的1.612 倍，提示rsl7563 位点CC 基因型可能会影响口腔颌面部的发育。本研究多因素分析显示，CT、TT 基因型是RAP 发生的保护因素(OR=0.319、OR=0.196)。出现这一结果可能与在高炎症水平环境下，可抑制BMP4、Smad1/ 5 磷酸化水平，在一定程度上对牙髓干细胞的成牙/ 成骨分化能力造成影响[19,20]。而rs17563 是惟一位于编码区域的SNP 位点，该位点普遍存在的高频碱基转换，可引起编码蛋白缬氨酸转变为丙氨酸，而两者均为疏水氨基酸，缬氨酸的异丙基结构较丙氨酸甲基大，多集中在蛋白质分子内部，T→C 错义突变则会引起活性部位的结构改变，进而使蛋白质活性丧失，降低BMP4 水平表达，进而增加RAP 发生风险有关。

综上所述，BMP2 和BMP4的基因多态性可参与RAP的发生，BMP2 基因rs235768 基因位点TT 基因型是RAP发生的危险因素，BMP4 基因rs17563 位点CT 基因型及TT 基因型是RAP 发生的保护因素。本研究不足之处在于选定基因的SNPs 数量有限，其具体影响机制尚需进一步研究，且样本选取较为局限，今后可将选取不同地区、不同族群进一步验证。