液相色谱-串联质谱法检测食品中 托曲珠利及其残留标志物

◎ 柯丽群，王同珍，张泳仪

（广东省中鼎检测技术有限公司，广东 东莞 523000）

托曲珠利是三嗪类抗球虫药物，具有高效、低毒和广谱的驱虫特性，在畜牧业生产中作为抗球虫药物被广泛应用。托曲珠利被动物吸收后，通过代谢转化为托曲珠利标志物，即托曲珠利砜[1-3]。托曲珠利的药效时间短，实际生产中需要长期给药，才能达到防治球虫的目的，因此此药物容易造成残留积累，经过食物链传递至消费者体内，影响消费者的身体健康。在生产中托曲珠利药物的使用有严格的限量标准，《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》 （GB 31650—2019）规定了托曲珠利标志物托曲珠利砜在家禽（产蛋期禁用）和所有哺乳类食品动物（泌乳期禁用）的肌肉中的最高残留限量为100 μg·kg-1[4-5]。

目前对托曲珠利的测定方法主要有液相色谱法[6-9]和液质法[10-11]。液相色谱法，测定时各种化合物之间的相互干扰较大，容易造成各个目标峰的结果不准确。由于托曲珠利的特征碎片离子较少，因此采用液质法测定该化合物时，通常采用母离子碎片信息定性定量，容易受基质效应的影响，造成测试结果不准确。本文对样品的提取、净化和仪器方法条件进行了优化，建立了具有高灵敏度和高选择性的高效液相色谱-串联质谱法，同时快速准确检测托曲珠利及其标志物托曲珠利砜，内标法定量，能够降低基质效应的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

H-Class-TQS-Micro液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；离心机（北京时代北利离心机有限公司）。

托曲珠利、托曲珠利砜，采购于德国DR.E公司；托曲珠利-D3、托曲珠利砜-D3，采购于德国WITEGA Laboratorien公司。

乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，Merck公司）；HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg，Waters公司）；0.22 μm水系滤膜（天津津滕公司）；实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

（1）标准贮存溶液配制。分别准确称取10 mg托曲珠利、托曲珠利砜及托曲珠利-D3、托曲珠利砜 -D3于10 mL的容量瓶中，用乙腈配成4份浓度各为 1 000 mg·L-1标准贮备液，-20 ℃保存。

（2）混合标准中间液配制。量取托曲珠利、托曲珠利砜贮备液置棕色容量瓶中，用乙腈稀释成浓度为10 mg·L-1混合标准工作液。

（3）混合内标中间液配制。量取托曲珠利-D3、托曲珠利砜-D3贮备液置棕色容量瓶中，用乙腈稀释成浓度为10 mg·L-1混合标准工作液。

（4）标准工作曲线溶液配制。准确移取适量混合标准工作液及混合内标工作液，用10%乙腈水稀释配制成1～500 ng·mL-1的系列标准溶液（内标均为40 ng·mL-1）。

（5）0.5%甲酸-30%甲醇提取液配制。取5 mL甲酸，300 mL甲醇置于1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

1.2.2 样品前处理

（1）提取。准确称取5.0 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL离心管中，准确加入混合内标工作液100 μL， 20 mL 30%甲醇水（含0.5%甲酸）溶液，漩涡混匀，超声提取15 min，4 500 r·min-1离心5 min，上清液备用。

（2）净化。HLB净化柱（200 mg，6 mL），预先依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，精确移取4 mL备用液，以1～2滴/s的速度通过净化柱，用5 mL 5%甲醇水淋洗，5 mL 90%乙腈10%甲醇洗脱，收集全部洗脱液于15 mL离心管中，置于45 ℃水浴下，氮吹至近干，准确加入1 mL 10%乙腈水溶解残余物，过0.22 μm聚砜醚针式滤头。滤液供液相色谱-串联质谱测定。

1.2.3 液相色谱-串联质谱条件

（1）液相色谱条件。Waters CORTECST UPLC C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相： 5 mmol·L-1乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：2 μL；柱温：45 ℃。液相色谱梯度洗脱程序：0～1.0 min，10% B；1.0～2.0 min，10%～90% B；2.0～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min， 90%～10% B；4.1～7.0 min，10% B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾电离（ESI-），毛细管：2.0 kV；锥口电压：25V；离子源温度：150 ℃； 碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：500 ℃；扫描模式：多反应监测模式。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别将托曲珠利、托曲珠利砜及2种内标的标准溶液配制成100 μg·L-1浓度的标准溶液，确定化合物的质谱条件，质谱参数优化结果见表1。

表1 托曲珠利等化合物质谱参数表

2.2 流动相的选择

本研究优化色谱流动相时，首先比较了乙腈-水体系和甲醇-水体系的分离效果。结果表明，当使用甲醇-水体系作为分离流动相时，化合物峰出现拖尾现象，故选择乙腈-水体系作为分离流动相。采用负离子扫描的质谱方法，为避免抑制负离子扫描模式下的离子化效果，流动相为不含酸体系。为进一步改善峰形，使用5 mmol·L-1醋酸铵代替纯水。

2.3 前处理条件优化

分别考察了乙腈-水（3∶7，V/V）、含0.5%甲酸的乙腈-水（3∶7，V/V）、甲醇-水（3∶7，V/V）、含0.5%甲酸的甲醇-水（3∶7，V/V）溶液的提取效果。乙腈和甲醇体系作为提取溶剂进行提取，均能得到良好的提取效果，但其中乙腈体系能够更好的沉淀蛋白，减少杂质的干扰，有利于下一步用HLB净化，因此选用乙腈体系作为提取溶剂。对比乙腈-水（3∶7，V/V）与含有0.5%甲酸的乙腈-水（3∶7，V/V）的提取效果，发现使用含有0.5%的乙腈-水（3∶7，V/V）时整体表现出更好的回收率，因此最终选用含有0.5%的乙腈-水（3∶7，V/V）作为提取溶剂。

2.4 线性范围及定量限

准确移取适量混合标准工作液及混合内标工作液，用10%乙腈水稀释配制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列标准溶液（内标均为40 ng·mL-1），依次从低浓度到高浓度进行分析，按照峰面积与对应的溶液的质量浓度做标准曲线，见表2。

表2 托曲珠利、托曲珠利砜的线性范围、相关系数及检出限表

2.5 回收率及精密度实验

以空白鸡蛋为样品，在5 µg·kg-1、20 µg·kg-1和100 µg·kg-13个水平下进行加标回收实验，每个水平平行测定7次，计算回收率和相对标准偏差，在优化后的实验条件下托曲珠利及其标志物的回收率为73.4%～104.7%，RSD≤9.2%，满足日常检测的要求，结果见表3。

表3 托曲珠利及其标志物回收率和相对标准偏差表（n=7）

3 结论

本研究建立一种托曲珠利及其残留标志物的液相色谱-串联质谱检测方法，样品经30%乙腈水（含0.5%甲酸）溶液提取，过HLB固相萃取柱净化。本方法中托曲珠利及其残留标志物在一定范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。通过优化前处理过程的提取溶剂，提高回收率和稳定性。该方法操作简便，灵敏度高，可满足食品中托曲珠利及其残留标志物的日常检测要求。