转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

龙丽坤，赵 宁，夏 蔚，李葱葱，董立明，闫 伟，李飞武

（吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，长春 130033）

0 引言

生物技术为全球农业科技注入强大的动力。转基因玉米是全球获得商业化批准最多的转基因作物。根据ISAAA(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)最新统计显示，2018年全球已批准商业化种植转基因作物31种，包括的517种转化体中237种为转基因玉米[1]。抗虫、耐除草剂转基因玉米品种选育是中国转基因专项重点研发领域之一。自2008年重大科技专项启动以来，中国转基因作物自主研发能力显著提升，大量转基因玉米新品系陆续进入环境安全评价阶段。CM8101转基因玉米是中国农科院自主研发，通过外源导入Cry1Ab-Ma和bar基因，具有优良的抗虫性和除草剂耐受性，是国内具有推广应用前景的转基因玉米新品系之一。对新品系CM8101转基因玉米建立准确可靠的检测方法，不仅是转基因产业发展的必然要求，也是中国转基因生物安全监管的技术支撑[2]。

目前，转基因作物检测主要基于核酸和蛋白质开展鉴定和分析[3]。基于核酸的转基因检测技术除传统PCR检测技术之外，等温扩增技术(LAMP)[4]、基因芯片技术(Gene chip)[5]、数字PCR技术(Digital PCR)[6-7]和生物传感器(Biosensor)[8]等新型检测技术也不断研发和应用，但这些新技术也存在问题和不足，如设备专业性强，技术要求高、易污染等。基于核酸的PCR定性检测方法具有成本低、灵敏度高、特异性强、操作相对简单等特点，成为国家标准、行业标准等推荐的主要转基因检测技术，并被广泛应用于研发单位和检测机构。CM8101作为新的转基因玉米品系，其特异性定性PCR检测方法尚未建立。本研究以抗虫、耐除草剂玉米CM8101转化体3’端插入位点的特异性序列为依据，建立转化体特异性定性PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行测试，旨在为对该转化体的安全评价、行政监管提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 转基因玉米CM8101、非转基因对照玉米Z58均为玉米纯合体，由中国农科院提供。

特异性测试样品中其他转基因玉米、转基因大豆、转基因棉花和转基因油菜等样品为粉末标准品，均由本实验室收集保存，涉及的各类作物转化体见表1。多种转化体按质量分数混合，分别制成混合样品，每个转化体含量为1%，以同种非转基因作物粉末为填充物。

表1 特异性测试包含的转基因作物

1.1.2 主要试剂 植物基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。Premix Ex Taq(Perfect Real Time)、DL2000分子量Marker购于大连宝生物工程有限公司。引物由上海生工生物公司合成。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备 台式冷冻离心机（美国eppendorf）、ND8000紫外分光光度计(Thermo scientific)、C1000型梯度PCR仪、GelDoc XR+凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 将所有样品粉末，按照植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化）操作说明书提取样品基因组DNA，ND8000紫外分光光度计测定DNA质量和浓度，用1×TE缓冲液将纯化的DNA溶液稀释至12.5 mg/L。

1.2.2 引物序列 CM8101玉米特异性扩增引物：8101-F7：5’-GGAAGCATAAAGTGTAAAGCC-3’；8101-R7：5’-CATTTCTTGGTCAAAACCTCAC-3’。扩增产物大小为242 bp。

内标准基因采用zSSIIb基因，参考农业部1861号公告-3-2012《转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法》，引物序列为：zSSIIb-1F：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’；zSSIIb-2R：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3’。扩增产物大小为151 bp。

引物由上海生工有限公司合成，用1×TE缓冲液稀释至10 μmol/L的工作液。

1.2.3 PCR反应 PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs混合溶液2 μL、10 μmol/L上下游引物各 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O补齐至25 μL。

PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行35个循环；72℃ 7 min；10℃。PCR扩增结束后，10 μL扩增产物经2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2 结果与分析

2.1 转化体特异性引物设计

根据CM8101玉米5’端和3’端边界序列信息（发明专利CN 109536490 A），采用引物设计软件Premier 5.0，设计转化体特异性引物7对，引物序列、位置及扩增产物大小等信息见表2。通过对低浓度DNA样品的测试，根据引物扩增条带清晰度、非特异性扩增以及引物二聚体多少等，选择表现相对优异的3’端引物序列8101-F7/8101-R7作为方法候选引物进行后续方法参数的测定。3’端边界序列及引物8101-F7/R7位置见图1。

表2 CM8101玉米特异性定性PCR检测引物信息

图1 CM8101玉米的3’端边界序列及引物位置

2.2 特异性检测

将CM8101制成质量分数1%的粉末，阴性对照为非转基因玉米粉末，其他转基因玉米混合样品、转基因大豆混合样品、转基因水稻混合样品、转基因棉花油菜混合样品、转基因油菜混合样品，作为特异性测试样品（见表1），提取样品DNA，按照常规PCR普通扩增体系进行内参基因zSSIIb和CM8101特异性片段的PCR扩增，测试本方法特异性。

内源zSSIIb基因扩增，作为DNA样品质量和纯度的质控，经PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示，仅在阴性玉米、CM8101玉米和其他转基因玉米出现玉米内源基因扩增条带(151 bp)，表明测试样品适用于特异性检测。

图2 特异性测试样品内标准基因zSSIIb扩增结果

CM8101特异性片段扩增电泳图谱见图3所示，仅在CM8101玉米样品中扩增出与预期大小一致的特异性PCR产物(242 bp)，其他转基因玉米、转基因大豆、转基因水稻、转基因油菜、转基因棉花样品中未得到任何扩增。因此，特异性检测结果表明，本方法具有严格特异性。

图3 特异性测试样品CM8101特异性片段扩增结果

2.3 灵敏度测试

将CM8101玉米基因组DNA与其非转基因玉米对照样品DNA按不同质量比混合，制成DNA质量分数分别为1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的CM8101玉米样品，进行方法灵敏度测试。每个扩增体系模板用量均为50 ng玉米基因组DNA，内参基因zSSIIb的扩增用于判定作为DNA样品提取质量如图4所示。特异性片段灵敏度测试结果如图5所示，PCR检测反应体系中加入50 ng玉米基因组DNA模板时，在电泳图谱上显示，1%～0.05%的特异性片段均有预期片段扩增，扩增产物经测序证实，该片段为预期的特异性序列。

图4 灵敏度测试样品内标准基因zSSIIb扩增结果

图5 灵敏度测试样品CM8101特异性片段扩增结果

2.4 检出限测定

为确定本方法检出限，借鉴中国已发布实施的转基因产品定性PCR检测方法标准的技术要求，使用CM8101玉米和非转基因玉米对照样品基因组DNA混合配制60份CM8101玉米DNA含量为0.1%的样品，进行PCR扩增。

结果如图6所示，60份试样均稳定扩增出预期大小一致的PCR产物，表明在PCR检测反应体系中加入50 ng DNA模板时，本方法的检出限可达到0.1%。单拷贝玉米基因组双链DNA的平均质量约为2.5 pg，由于本研究中使用CM8101玉米为纯合体，因此，本检测方法的检出限约20拷贝。因此，本方法适用于对抗虫耐除草剂玉米CM8101品系的高灵敏检测。

图6 CM8101玉米检测方法检出限测定

2.5 稳健性测试

为了测试本特异性PCR方法对CM8101检测的稳健性，针对PCR检测方法的反应体系和反应程序，以1%的CM8101为模板，选择退火温度和引物浓度梯度2个关键参数进行正交试验。退火温度设置分别为52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃，引物浓度梯度为0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，共测试24个退火温度/浓度梯度组合。结果见图7，图中可见，不同的引物浓度和退火温度处理中本方法均表现出良好的扩增特异性，不同退火温度表现出较为一致的扩增效率，特异性扩增条带清晰、无非特异扩增、引物二聚体较少，因此本方法可以稳定地检出CM8101特异性片段，再现性良好。

图7 CM8101玉米特异性PCR法退火温度的稳定性测试

综合考虑玉米内标准基因zSSIIb的定性PCR检测方法的反应体系和反应程序，结合本研究结果，反应体系中的引物终浓度建议采用0.2 μmol/L，反应程序中的退火温度设定为58℃。

3 讨论

随着转基因新品种研发和产业化推进，作物安全评价和监管面临更多挑战，迫切需要不断开发更精准、快速、高通量检测方法提供技术支撑[9-10]。PCR技术是应用最广泛的转基因检测方法，以PCR为主要技术手段的转基因检测分为4类，即转化元件筛选检测[11]、靶标基因检测[12-14]、构建载体特异性检测[15]和转化体特异性检测[16]。Datukishvili等[17]建立了CaMV35S、Nos、EPSPS和Cry1Ab4个转基因参数的多重PCR检测体系，检测限可以达到0.1%的RRS大豆和MON810玉米。应用数字PCR技术Fu等[18-20]，建立了无需预处理的定性筛选检测方法，实现了转基因作物的快速筛选。但研究表明，此类方法对多种转基因转化体难以达到一致的检测限。对新研发的转基因作物，仍需验证其适用性。

转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101是由中国农科院研发的转Cry1Ab-Ma基因和bar基因抗虫耐除草剂玉米新品系，经多年多点鉴定表明，该品系对玉米螟、棉铃虫、粘虫等鳞翅目害虫具有良好的抗虫性、同时兼具草铵膦除草剂耐受性，在中国具有重要产业化应用前景，因此，对CM8101转基因玉米建立一种稳定可靠的特异性检测方法是安全评价和监管的必要支撑。

转化体特异性PCR检测方法靶标主要是外源插入序列与靶标物质基因组连接区域的DNA序列，这种方法具有高度的专一性，是转化体特异性检测的最广泛应用的检测方法，已成为国际上转基因作物研发和安全评价中的基本技术要求[21]。目前，大多数商业化转基因作物品系均已建立定性PCR检测体系，应用于转基因品系特异性鉴定和分析。Jae-HwanKim等应用多重PCR技术建立了16种转基因玉米五重PCR鉴定方法[22]。利用Realtime PCR技术各国学者陆续建立了转基因玉米BVLA430101、98140等转化体特异性定性定量检测方法[23-24]，这些新方法检测特异性强，检测限达到0.1%～0.25%。但这些方法普遍存在技术要求较高、需要标准物质等问题。本研究建立的CM8101凝胶检测的定性PCR检测方法，设备普及率高，成本低，技术适用范围广。本方法检测灵敏度达到0.1%，检测限为20 copies，与各类新方法达到相同的分辨力水平。因此易于在中国众多研发单位和检测机构推广应用[25]。

本研究以转基因玉米CM8101 3’端插入位点特异性序列为依据，通过筛选检测引物、优化反应体系、反应程序等技术参数测试，建立了CM8101的转化体特异性定性PCR检测方法，达到了与现行有效的其他同类转基因植物及其产品成分检测方法标准相同的技术指标，同时本方法考虑到与其他相关国家标准的兼容性，确保在实际工作中能够将本方法与其他标准高效配合使用。

4 结论

基于转基因玉米CM8101的3’端特异序列，应用普通PCR技术，本研究建立了CM8101定性鉴定方法。结果表明：本方法能够精准检测出CM8101玉米样品，具有良好的品系特异性，方法检测灵敏度可达0.1%。本方法各项技术指标能够满足《农业转基因生物安全管理条例》转基因作物安全监管的技术要求，可为转基因玉米CM8101的鉴定提供有效的技术手段。