鼻咽癌组织中BLU与cyclin D1和cyclin B1的表达及其临床意义

朱振潮，邱前辉，詹建东，张弛

(1. 南方医科大学珠江医院 耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州 510282； 2. 广东省人民医院 广东省医学科学院 耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州 510080)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国华南地区最常见的恶性肿瘤之一，其发病部位隐匿，早期症状不明显，且容易较早发生淋巴结或远处转移[1]。放疗是其最主要的治疗手段，虽然随着影像学水平和放疗技术的提高，NPC的局部区域控制率得到明显的提高，但淋巴结或远处转移率仍未见明显下降[2]。因此，寻找NPC发生发展的重要靶向标志物，对肿瘤精准治疗及预后判断等具有重要的指导意义。

Zinc-finger, MYND-type containing 10 (ZMYND10)，简称为抑癌基因BLU，是在人类染色体3P21.3区域内被检测到的第1个与NPC相关的抑癌基因[3]。之后在许多关于BLU的报道中，BLU基因在众多肿瘤中频繁下调或缺失，提示其可能是肿瘤发生发展的重要靶向因子[4]。cyclin D1是细胞分裂周期G1间期中最重要的正性调控因子，研究发现，其表达上调，将造成G1间期缩短，细胞会提前进S期，使其进程加快、增殖失控，最终导致肿瘤的生成[5]。而cyclin B1由CCNB1基因编码，是细胞分裂周期G2/M期中关键的周期蛋白，同样已被各种研究证明其在肿瘤发生、发展中起关键作用[6]。

目前国内外有关NPC发病和预后的相关研究越来越多，但是 BLU、cyclin D1和cyclin B1三者在NPC组织中的表达及临床意义却鲜有报道。因此，我们采用免疫组化法检测NPC组织及慢性鼻咽炎(chronic nasopharyngitis, CN)组织中BLU、cyclin D1与cyclin B1的表达情况，分析其与患者临床病理参数及预后之间的关系，为揭示NPC发生发展的疾病机制及预后评估提供客观依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集自2009年12月—2011年8月于广东省人民医院就诊并进行鼻咽部组织活检且病理确诊为NPC患者97例，其中男74例，女23例；年龄17～71岁，平均年龄(50.8±11.4)岁。肿瘤临床分期采用2010年美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)的分期标准。其中T1 25例、T2 28例、T3 23例、T4分21例；N0 21例， N1～N3 76例；M0 90例，M1 7例。临床分期中I期14例、II期26例、III期28例、IV期29例。非角化未分化型癌85例，非角化分化型癌7例，低分化鳞状细胞癌5例。所有患者在收集标本时，均未接受放疗或化疗等临床治疗。所有患者确诊后行标准化根治性放疗加同步化疗。所有患者均通过电话和(或)门诊复查的形式进行随访，随访时间自患者鼻咽癌确诊后行治疗当日开始计算，至最后的随访时间为2016年11月15日，随访结局分别是：死亡、存活及失访。总体生存期(overall survival，OS)指的是标准化治疗开始的时间到患者死亡或最后一次随访的时间。NPC患者有无淋巴结转移均以MRI报告确定。另外，随机选取同期于广东省人民医院耳鼻咽喉科门诊行鼻咽部活检病理证实为CN组织标本，共36例，其中男24例，女12例；年龄19～58岁，平均年龄(32.4±10.3)岁。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 检测方法

组织石蜡包埋后常规2 um切片，67℃烤片2 h。二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化处理。然后用枸橼酸钠缓冲溶液进行抗原修复，用3%过氧化氢孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶的活性，将BLU、cyclin B1和cyclin D1(Abcam，USA，兔抗)均以1∶100浓度稀释液滴加到每张切片上，于4℃冰箱过夜。滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS液漂洗后滴加DAB溶液显色5 min。苏木素复染后封片观察。上述操作以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 检测结果判定

采取独立双盲法判定免疫组化的实验结果，具体为由两位具有10年或以上病理诊断工作经验的病理科医师分别进行独立阅片，随机在显微镜200倍镜下进行评估。根据切片的染色强度及阳性细胞率得分之积进行判断。其中染色强度评分标准为：无着色0分，弱着色(浅黄色)1分，中等着色(棕黄色)2分，强着色(黄褐色)3分。阳性细胞率判断方法为为：阳性细胞≤5%：0分，6%≤阳性细胞≤25%：1分，26%≤阳性细胞≤50%：2分，阳性细胞>50%：3分。两项乘积结果为评分标准：0分为阴性(-)，1～4分弱阳性(+)，5～8分中等阳性(++)，9～12分强阳性(+++)，按照上述评分方法判断出的弱阳性、中等阳性及强阳性均标记为阳性。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 22.0(version 22.0, Inc, Chicago, IL, USA)统计学软件进行统计，P<0.05为差异具有统计学意义。各组阳性率比较采用χ2检验或确切检验法(Fisher法，n<5时)，两种蛋白表达的相关性分析采用Spearman等级相关分析法。以Kaplan-Meier法计算患者总生存率，绘制出生存曲线，进一步采用Log-rank检验比较各组生存率的差异，最后采用Cox比例风险模型进行多因素分析，观察影响NPC预后的独立危险因素。

2 结果

2.1 BLU与cyclin D1、cyclinB1在NPC及CN组织中的表达情况

BLU在NPC或CN组织的阳性反应使细胞呈黄褐色或棕黄色，阳性表达主要定位在细胞浆为主。BLU在NPC组织中的阳性表达率为67.0%(65/97)，而在CN组织中的阳性表达率为88.9%(32/36)，二者差异具有统计学意义(χ2=6.366，P=0.008)；cyclin D1主要表达在NPC组织细胞中的细胞浆或细胞核，其在NPC组织的阳性表达率为64.9%(63/97)，而CN组织的阳性表达率为27.8%(10/36)，二者差异具有统计学意义(χ2=14.651，P<0.001)；cyclin B1在NPC组织的表达在细胞浆或细胞核，其在NPC组织中阳性表达率为60.8%(59/97)，在CN组织的阳性表达率则为22.2%(8/36)，二者差异有统计学意义(χ2=15.651，P<0.001)。具体见表1、图1～3。

表1 BLU、cyclin D1和cyclin B1在NPC和CN组织中的表达

图1 BLU在NPC组织和CN组织中的表达 (SP ×200) 1A：BLU在NPC组织低表达；1B：BLU在CN组织高表达 图2 cyclin D1在NPC组织和CN组织中的表达 (SP ×200) 2A：cyclin D1在NPC组织高表达；2B：cyclin D1在CN组织组织低表达 图3 cyclin B1在NPC组织和CN组织中的表达 (SP ×200) 3A：cyclin B1在NPC组织高表达；3B：cyclin B1在CN组织低表达

2.2 BLU与cyclin D1、cyclin B1在NPC组织中表达及临床病理参数间的关系

NPC组织中BLU表达与年龄、T分期有相关性(P<0.05)，与性别、临床分期、淋巴结转移、病理类型及远处转移无关(P>0.05)；cyclin D1表达与临床分期、淋巴结转移有相关性(P<0.05)，与性别、年龄、T分期、病理类型、远处转移及生存状态无关(P>0.05)；cyclin B1表达与临床分期与T分期有相关性(P<0.05)，与性别、年龄、淋巴结转移、病理类型、远处转移及生存状态无关(P>0.05)。见表2。

表2 97例NPC组织中BLU、cyclin D1和cyclin B1表达与临床病理参数间的关系 (例)

2.3 BLU与cyclin B1、cyclin D1在NPC组织中表达相关性

采用Spearman等级相关分析法三者的相关性，结果显示：BLU与cyclin D1在NPC组织中表达呈负相关(r=-0.378,P=0.011)，BLU与cyclin B1在NPC组织中表达无明显相关性(r=0.096,P=0.089)，cyclin D1与cyclin B1在NPC组织中表达无相关性(r=0.084,P=0.191)。

2.4 BLU与cyclin B1、cyclin D1在NPC组织中表达与预后关系

本研究首先采用Kaplan-Meier法对纳入的患者进行总体生存率估计，其中5年累积生存率为75%，中位生存期为70个月。BLU表达阳性组的生存率高于表达阴性组，二者差异有统计学差异(P<0.05)，见图4。cyclin D1组表达阳性组生存率低于表达阴性组，二者差异有统计学差异(P<0.05),见图5。cyclin B1组表达阳性组与表达阴性组生存率差异无统计学差异(P>0.05),见图6。

图4 抑癌基因BLU不同表达患者的生存曲线

图5 cyclin D1不同表达患者的生存曲线

图6 cyclin B1不同表达患者的生存曲线

进一步采用Log-rank法(单因素分析)研究BLU与cyclin B1、cyclin D1的表达及各临床病理参数对NPC患者预后的影响，结果显示：BLU、cyclin D1、T分期、N分期与患者的预后有关，而年龄、性别、临床分期、病理类型、远处转移与患者的预后无关。

最后采用Cox回归模型(多因素分析)显示BLU、cyclin D1及淋巴结转移是NPC预后的独立预测因子，其余年龄、性别、临床分期、T分期、病理类型和远处转移不能单独预测疾病的预后。见表3。

表3 NPC患者Cox回归风险模型多因素分析结果

3 讨论

抑癌基因BLU全称为Zinc-finger, MYND-type containing 10 (ZMYND10)，其蛋白的结构包含MYND结构域的C端区域，该域由几个半胱氨酸和组氨酸氨基组成的残基[7]。BLU在很多正常人组织类型中具有高度表达，而在许多恶性肿瘤中表达明显下调。本研究同样证实，BLU在NPC组织表达下调，与目前普遍的研究结果一致[8-10]。本研究结果发现，BLU表达水平与年龄、T分期有相关性。这提示BLU表达下调，可能与NPC局部浸润有关，并促进临床分期进展。BLU与NPC患者年龄相关，提示可能随着年龄增大而BLU下降，具体的机制仍有待阐明，目前仍无相似研究结果。而国外学者研究显示[10]，BLU在NPC组织中表达与组织病理类型相关，与本研究不一致，可能是实验方法不同或人种差异所致。本研究进一步发现，BLU高表达组的生存率高于低表达组，进行单因素和多因素分析同样显示BLU与NPC预后相关，可能是NPC预后独立预测因子。我们认为，BLU可能成为NPC预后的预测指标之一，本研究初步提供了客观实验依据，但仍需临床进一步验证。

本研究显示，cyclin D1在NPC组织的阳性表达率与CN组织的阳性表达率相比明显升高，进一步发现cyclin D1表达水平与临床分期与淋巴结转移有相关性，并且单因素及多因素分析提示其是NPC预后的独立预测因子。纵观文献发现，许多恶性肿瘤包括食管癌、卵巢癌、乳腺癌以及头颈部癌等的诸多研究都报道了cyclin D1表达水平的升高[11-12]，与本研究较为一致。同样地，国内外一些体外和体内实验均表明，cyclin D1高表达与肿瘤浸润生长、淋巴结转移和远处转移密切相关[13]。这强烈提示，cyclin D1在恶性肿瘤中异常高表达，可能使G1间期提前进S期，造成细胞失控性增殖。我们的研究显cyclin D1是NPC预后的独立影响因素，其表达升高可能与NPC患者不良预后相关，可能成为NPC预后的预测指标之一。

cyclin B1在正常组织细胞中表达水平极低，仅于细胞间期G2/M转变时期一过性急剧升高，调节细胞周期进程[14]。本研究中，cyclin B1在NPC组织的阳性表达率高于CN组织的阳性表达率，与国内外研究报道一致，因此我们推测其表达上调，导致细胞周期不受限制，从而肿瘤发生发展。另外，cyclin B1表达水平与临床分期、局部浸润有相关性，最后进行预后分析发现，cyclin B1并不能预测NPC患者的预后情况。但文献回顾可以发现，众多研究提示cyclin B1是一种有价值的预后指标，也是实体瘤的潜在治疗靶点[6]。而我们的研究表明，细胞cyclin B1表达与NPC预后无明显相关性，与大多数实体瘤研究结果不一致，可能是不同研究方法和样本量差异所致。因此，cyclin B1在恶性肿瘤中被广泛研究，而研究结果又有所差别。正是这些差异表明，进一步研究cyclin B1，有助于阐明其在不同肿瘤类型的发病机制和预后价值。

本研究拟采用Spearman相关分析方法发现，BLU与cyclin D1在NPC组织中表达呈负相关，这可能提示NPC中BLU表达下调可能促使cyclin D1高表达，导致细胞分裂周期失控，从而肿瘤细胞发生发展。Zhang等[15]通过体外实验表明，BLU基因高表达能抑制JNK信号通路的活性，降低cyclin D1的表达水平，从而使细胞周期阻滞于G1，明显抑制NPC细胞克隆形成。另有Park等[16]研究发现，BLU增强了化疗药紫杉醇对肿瘤的抑制作用，其通过减少细胞周期蛋白依赖性激酶1、cyclin B1，同时促进p16和p27表达，诱导G2/M期的细胞周期停滞。类似地，Zhou等[17]的研究显示，BLU通过抑制NF-κB通路增强了死亡受体诱导，认为BLU通过增强抗肿瘤免疫力来抑制肿瘤形成。还有研究采用PCR列阵法，发现BLU基因的过表达与NPC细胞中的血管生成网络相关，提示BLU可能直接参与了NPC发展的微环境和抗新生血管生成活动[9]。

综上所述，BLU表达下调，而cyclin B1和cyclin D1高表达，可能在NPC发生发展中产生重要作用，而BLU与cyclin D1有可能成为其中评估NPC预后的生物学标志物。但BLU、cyclin D1和cyclin B1如何互相影响，信号通路中上下游分子不同表达，仍未得到验证，未来我们将验证该基因的信号通路，为阐述NPC的发生发展机制及预后评估提供更完善的客观依据。