一例猫耳痒螨病的诊断及螨虫的分子鉴定

鞠 皓，吴婷婷，樊佳鹏，邓小丽，常巧呈,2*

1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省牛病防控工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319

猫耳痒螨病是痒螨科耳痒螨属猫耳痒螨引起的高度接触性传染病寄生虫。主要寄生于猫和狗外耳道及临近皮肤，并引起强烈刺激，引起中耳炎，可分泌大量棕黑色耳垢[1]。耳部的瘙痒感可导致患病动物摩擦、抓挠自己的耳朵，并剧烈的摇头，严重时耳廓有血肿产生。由于猫耳痒螨的传染性强，能够感染接触到的动物甚至人类，且虫体抵抗力较强，能在6～8 ℃的畜舍内存活2个月左右，在-25 ℃时经6 h才死亡。导致该病在世界范围广泛存在，如美国、西班牙、意大利等其他国家，且该病的发病率较高，同窝猫中一只发病其它基本都可检出耳痒螨，但致死率不高。近年来随着人们对宠物猫、狗的养殖数量越来越多，致使耳痒螨病也愈发严重，患有螨虫疾病的猫严重影响观赏价值，给宠物主人带来很大困扰，过去常以观察病理变化结合镜检作为诊断猫、犬耳螨病的诊断依据。随着分子生物学的发展，人们不应仅局限于镜检和形态学观察，越来越多的学者和技术人员更加倾向于用更为准确地标记基因技术来诊断疾病。真核生物的线粒体cox1在细胞中含量高且序列高度保守，并在其遗传基因中处于十分重要的作用。选择该基因作为分子诊断对寄生虫病进行分析对比比较理想。本研究拟对猫耳部螨虫进行形态学观察的基础上进一步应用分子生物学方法进行鉴定，达到准确鉴定病原目的。

1 材料与方法

1.1 背景

2020年11月上海市某宠物医院收留一只3月龄流浪公猫，临床检查猫双耳耳廓外侧局部脱毛，两侧的耳道内有大量黑褐色分泌物，双耳均有异味，猫因瘙痒抓挠，导致耳部皮肤增厚发红，其他部位未见明显异常。同时在检查过程中患猫敏感抗拒耳部检查。对猫耳部刮取病料并收集分泌物进行检查。

1.2 主要试剂

基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，DL-2 000 Marker、2×Tamaster Mix，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 临床病理诊断

刮取耳部病变组织至轻微出血，将病猫外耳道的部分分泌物装入5 mL离心管，用10 mL针头挑取一部分将其放在载玻片上，滴一滴37 ℃的温生理盐水稀释后在显微镜下分别用40×和100×观察并剥离虫体与分泌物及病变组织发现有螨虫，观察到雄虫第3、4对足末端有吸盘，雌虫没有，雄虫有两个不发达的尾突,着重观察，形态对比后,结合猫耳部渗出物及病理变化初步诊断为猫耳痒螨。

1.4 虫体收集

将少量刮取的分泌物放置于载玻片上，滴一滴生理盐水，用10 mL或20 mL针头将分泌物搅匀。在显微镜下观察挑去单个虫体,收集20～30只螨虫装于1.5 mL离心管中。

1.5 DNA提取

将收集的螨虫研磨，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并置-20 ℃冰箱保存，备用。

1.6 线粒体cox1序列的扩增

应用相关文献中引物序扩增螨虫cox1部分序列。列扩增目的引物序列为：上游引物5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3'和下游引物5'- TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA -3。PCR扩增体系（总体积为25 µL）：2xTap Master Mix(Dye Plus)12.5 µL，上下游引物各0.5 µL，模板DNA 1 µL，ddH2O 10.5 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸7 min。取PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 线粒体cox1测序及进化分析

将PCR扩增产物送库美生物科技有限公司测序，测序结果用DNASTAR 5.0软件分析，与GenBank现有的不同地区具有代表性的耳痒螨属的cox1部分序列和痒螨科的不同属的cox1部分序列进行比较分析,以及对猫身上可能存在的所有螨虫的cox1部分序列进行分析比较。用EditSeq软件和MEGA7.0.26软件对本试验中及GenBank上相关cox1部分序列比对分析，采用分子系统发育分析的最大似然方法（ML）对所有可能的拓扑结构进行计算，构建进化树。

2 结果与分析

2.1 病原镜检

参考书《兽医寄生虫学》第九版书中对螨虫的介绍及对螨虫虫体的鉴定，在低倍镜进行可发现大量不同时期螨虫虫体。从背部观察雌虫可以明显看到三对足，看不到第四对足，第三对足上各有两根很长的毛，并且第三对足没有吸盘，身体后半部分较为规则比雄虫略大。从背部观察雄虫可以明显看到四对足，第四对足较小，第三对足也各有两根长毛，且第三、四对足上有吸盘。幼虫体型较成虫小1～2倍，幼虫没发育出第四对足。结合患病部位和镜下观察，初步鉴定为猫耳痒螨。

2.2 线粒体cox1序列扩增

提取虫体DNA，用特异性引物扩增猫耳痒螨部分cox1序列，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示cox1部分序列大小为700 bp左右（见图1），与预期结果相符。

图1 cox1 PCR扩增产物M DL-2000 Marker;1 cox1;2 阴性对照

2.3 猫耳痒螨与痒螨科内其他属cox1序列的进化及分析

测序结果显示获得的cox1部分序列长度为706 bp,并提交Genbank（MW350132.1）。该序列与GenBank公布的猫耳痒螨中国西安株（KP676679.1）cox1序列同源性99.69%。说明本试验中扩增的螨虫是猫耳痒螨。以璃眼蜱为外群与痒螨科中各属螨的线粒体cox1部分序列和猫身上存在的其他螨虫线粒体cox1部分序列构建进化树建树。结果显示，形成痒螨科和疥螨科两大分支，同为痒螨科的足螨属、耳痒螨属等虫体在同源性相似在同一分支上。

图3 痒螨科与疥螨属的cox1部分序列建树图

3 讨论

患病猫临床表现主要为精神不振，身体消瘦，四肢无力，外耳道有明显黑色结痂物质，这与临床猫耳螨病的典型症状相同[2]。刮取耳部黑色分泌物进行镜下检查发现分泌物中含有螨虫与猫耳痒螨的形态学基本一致[3]。形态学观察对体型较小、种类繁多、形态较为相似的螨虫，准确度较低，为了对该虫体的准确诊断，可以运用分子生物学方法扩增猫耳痒螨线粒体cox1部分序列。

线粒体cox1序列以其长度适中、进化缓慢、难发生基因水平转移等优点，可以被用来螨虫鉴定及探讨虫种间及种内亲缘关系。对扩增的该螨虫cox1部分序列在NCBI上Nucleotide BLAST寻找与该基因相似的基因，得出本实验中上海猫耳痒螨线粒体cox1序列与Genback上已经有的序列西 安 株（KP676679.1）和（ KP676678.1）同 源性均高于99.00%，且在遗传进化树上与江苏两株（KP676679.1）和（KP676678.1）的猫耳痒螨处于同一分支，该条测序结果可以作为实验中螨为猫耳痒螨的有利证据，根据镜下的形态学鉴定与分子诊断技术相结合可以更为准确的确定病原虫体，证明本实验中螨虫是猫耳痒螨。与猫身上可能存在的疥螨线粒体cox1种类进行建树，发现猫耳痒螨与疥螨的同源性较低，可以用分子诊断技术准确确定猫身上可能存在的螨虫种类，其中猫身上存在其他螨的种类较多，但在Genback中上传的有关序列较少，有待探讨。

对螨虫虫种的准确鉴定不但对科学研究具有重要意义，同时也对临床病例的治疗有指导作用。因为药物对虫卵没有驱杀效果，所以治疗螨虫必须间隔一定时间再用药一次。通常情况在不进行虫种鉴定的情况下一般要间隔7 d[4]。由于不同种类的螨虫的生活史不同，尤其是虫卵发育为幼虫的时间不同。例如疥螨卵的发育时间一般为3～5 d，则一个治疗周期至少为5 d，而耳痒螨卵的发育时间较短，一般为4 d，这对治疗方案有较大的参考价值，可以不必等7 d间隔用药，采用4 d间隔用药极大的节约了时间，并减少了宠物的痛苦。本研究在国内首次应用形态学方法和分子生物学相结合的方法对猫临床螨病进行诊断和虫种鉴定，最终确定该螨病的病原是猫耳痒螨，研究结果为猫螨病的治疗提供了依据。