蓝莓粗提物HPLC色谱条件考察*

李冰晶，罗丽平，赵景芳，王代波，刘国华，文光琴

(1贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009；2贵州省植物园，贵州 贵阳 550009)

蓝莓(Vacciniumuliginosum)，又称越桔或蓝浆果，属杜鹃花科越桔属落叶灌木植物，蓝莓中含有非常丰富的营养成分，被誉为“浆果之王”[1]，果实中含有丰富的维生素、膳食纤维、蛋白质和矿物质等营养元素，其中蓝莓中花青素含量较高。蓝莓果实中含有的活性物质具有抗衰老、缓解视疲劳、改善记忆力、抗氧化、抗癌症等功效[2]。

蓝莓中含有多种活性物质，花青素为其中含量较高的一种[3]。为了更好地研究蓝莓粗提物中成分，利用高效液相色谱(HPLC)对蓝莓提取物进行分析[4-10]，通过单因素分析法，考察流动相组成、流速、柱温、进样量和时间梯度等对蓝莓粗提物分离的影响，从而确定出HPLC测定蓝莓粗提物的最佳条件。

1 实验材料

1.1 实验原料与试剂

蓝莓，由麻江羊盖蓝莓基地提供；乙醇(食品级)；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；磷酸(分析纯)；乙酸(分析纯)；蒸馏水；AB-8型大孔树脂，购于上海蓝季。

1.2 实验仪器

Agilent1260高效液相色谱；BUCHI R114旋转蒸发仪；DZF-6021真空干燥箱；722S型可见光分光光度计；GTR16-2型离心机；DKS-28型电热恒温水浴锅；电子天平A2004；PHSJ-4A型PH计；DW-4OL262型医用低温保存箱；BCD-206SM型海尔冰箱。

2 实验方法

2.1 样品制备

将新鲜蓝莓称重置于烧瓶中，加入75 %的乙醇密封避光浸泡15 d。过滤，浓缩提取液，用大孔树脂对浓缩液进行初步分离，得到水洗脱的蒸馏水流份和乙醇洗脱的蓝莓提取物流份，浓缩蓝莓提取物流份，得到蓝莓粗提物。

2.2 HPLC色谱条件考察

影响高效液相色谱分离蓝莓粗提物的条件有柱选择、流动相、流速、柱温、时间梯度和进样量等，本试验通过单因素分析法考察流动相、流速、柱温、进样量和梯度洗脱条件五个方面，从中选择出最佳的测试条件进行蓝莓粗提物液相色谱测定[11-17]。

2.3 波长及流动相筛选

以蓝莓粗提物作为考察对象，通过全波长扫描，得出目标产物在529 nm处有最大吸收，因此以529 nm波长最为主要波长。

常用的HPLC流动相有：水、磷酸水、甲醇、乙醇、乙腈等，以Agilent C18柱为色谱柱，分别以水-甲醇、乙酸-甲醇、磷酸水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-乙腈、乙腈-乙酸为流动相，进行梯度洗脱，考察色谱峰的分离效果，选出最佳流动相。

2.4 流速筛选

高效液相色谱流速的改变会影响图谱的出峰时间和峰形，本试验通过比较在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三个流速下蓝莓花青素的分离情况，比较各组流速的HPLC图谱，根据图谱选择出能分离蓝莓花青素的HPLC流速。

2.5 柱温筛选

温度会影响溶剂的密度、粘度等物理性质，所以高效液相色谱柱温的改变会对谱图中峰的分离效果、峰形及出峰时间产生影响。本试验通过对20 ℃、25 ℃、30 ℃三个柱温下蓝莓粗提物的HPLC图谱进行比较，根据图谱筛选出能最好分离蓝莓粗提物的HPLC柱温。

2.6 进样量筛选

高效液相色谱的进样量不同，会对样品的峰形和峰面积产生较大影响，本试验通过对5 μL、10 μL、20 μL 三个体积进行考察，对HPLC图谱进行比较，筛选出能最好分离蓝莓粗提物的HPLC进样量。

2.7 梯度洗脱条件筛选

高效液相色谱的梯度洗脱条件不同，会影响其样品出峰时间和分离程度，本试验对洗脱时间和梯度的调整，对HPLC图谱进行比较，根据图谱筛选出能最好分离蓝莓粗提物的HPLC梯度洗脱条件。

3 实验结果

3.1 流动相考察结果

通过对水-甲醇、水-乙腈、0.3%磷酸-甲醇、0.3%磷酸-乙腈、0.5%乙酸-甲醇、0.5%乙酸-乙腈这6种流动相的考察，得出分离效果最好的图谱，见图1。通过分析比较图谱，当以0.3%磷酸-乙腈作为流动相时分离效果明显优于其他流动相条件下的分离效果。因此最终确定了乙腈(A)-0.3%磷酸(B)为花青素HPLC实验流动相。

图1 流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸(B)液相图谱Fig.1 Chromatogram with mobile phase of acetonitrile(A)and0.3% phosphoric acid (B)

3.2 流速考察结果

通过对0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三个流速的比较，得出图2-图4，从图中可以看出，流速对花青素的峰分离效果和保留时间没有太大影响，但是流速过快，会导致基线不稳，流速过慢，会拉长分离时间，加大能耗。综合考虑，选择1 mL/min作为花青素HPLC实验流速。

图2 流速0.8 mL/min液相图谱Fig.2 Chromatogram with flow rate of 0.8 mL/min

图3 流速1 mL/min液相图谱Fig.3 Chromatogram with flow rate of 1 mL/min

图4 流速1.5 mL/min液相图谱Fig.4 Chromatogram with flow rate of 1.5 mL/min

3.3 柱温筛选结果

经对20 ℃、25 ℃、30 ℃3个柱温进行考察，得出图5-图7。从图中可看出，随着柱温的升高，峰的分离效果和保留时间基本没有变化，但是峰形逐渐变得更完整，因此选择30 ℃为花青素HPLC法测定的柱温。

图5 柱温20℃液相图谱Fig.5 Chromatogram with column temperature of 20 ℃

图6 柱温25℃液相图谱Fig.6 Chromatogram with column temperature of 25℃

图7 柱温30℃液相图谱Fig.7 Chromatogram with column temperature of 30℃

3.4 进样量筛选结果

根据蓝莓粗提物的浓度，本试验对5 μL、10 μL、20 μL 3个进样量进行考察，如图8-图10所示： 5 μL时响应值较低，约为10 mAU；而20 μL时响应值较高，约为180 mAU；应选择峰值在100 mAU较为合适，故选择10 μL作为进样量。

图8 进样量5 μL液相图谱Fig.8 Chromatogram with injection volume of 5 μL

图9 进样量10 μL液相图谱Fig.9 Chromatogram with injection volume of 10 μL

图10 进样量20 μL液相图谱Fig.10 Chromatogram with injection volume of 20 μL

3.5 梯度洗脱条件筛选结果

先选择0～100 min，A：0%～30%，B：100%～70%，观察出峰情况和保留时间。从图11可知前10 min出峰为溶剂峰，10～50 min出峰多且密集，后40 min基本不出峰。将时间调整为0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%，观察出峰情况和保留时间，从图12可知，40～70 min出峰多且密集。将时间调整为0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，观察出峰情况和保留时间，从图13可知，出峰基本分开，峰形较好。综上所述，选择时间：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%为花青素HPLC梯度洗脱条件。

图11 洗脱梯度为0-100 min，A：0%-30%，B：100%-70%液相图谱Fig.11 Chromatogram with gradient elution program of0-100 min，A：0 %-30 %，B：100 %-70 %

图12 洗脱梯度为0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%液相图谱Fig.12 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70 min，A：5 %-15 %-30 %，B：95 %-85 %-70 %

图13 洗脱梯度为0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%液相图谱Fig.13 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70-100 min，A：8 %-10 %-15 %-30 %，B：92 %-90 %-85 %-70 %

4 结论与分析

本试验考察了在用HPLC的测定蓝莓粗提物时影响其分离和保留时间的5个因素(流动相、流速、柱温、进样量和梯度洗脱条件)，通过单因素分析法，逐一控制影响因素，根据所得图谱逐一分析出用HPLC的测定蓝莓粗提物最佳测试条件。由于所探究的目标产物在529 nm处有最大吸收，因此以529 nm波长最为主要波长。在流动相选择时，当流动相为：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)蓝莓粗提物分离最好。流速和柱温对图谱的出峰和保留时间影响都较小，但是流速越快，会导致基线不稳，而流速越慢，温度越高峰形越趋于完美。但也不宜速度过慢和柱温过高，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃时，效果最好。进样量对峰面积影响较大，应选择峰值在100 mAU较为合适，所以选择10 μL作为进样量。根据时间和浓度确定梯度洗脱条件，经过调整时间和浓度，最终确定梯度洗脱条件为时间：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%时，蓝莓粗提物的分离效果最好。

综上所述，在色谱条件筛选中所确定的各项最佳条件的基础上对色谱条件进一步优化，确定了最终实验的色谱条件为：当流动相为：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)；波长为529 nm；流速1 mL/min；柱温 30 ℃；进样量10 μL；梯度洗脱条件为：时间：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，此条件下蓝莓粗提物的HPLC图谱分离效果较好。