不同酿酒酵母对白兰地香气的影响研究

刘晓露，李记明，阮仕立，王根杰，张葆春，毕芸杰，姚圣圣，张舒凡，冯 磊，赵玉平*

（1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264003；2.烟台张裕集团有限公司 山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东 烟台 264001）

白兰地通常是以葡萄为原料，经过发酵、蒸馏、贮藏以及陈酿而成[1-2]。其香气成分非常复杂，其来源主要来源于以下三个方面[3-5]：品种、发酵过程及陈酿过程。香气是衡量白兰地感官品质的重要组成部分。香气成分的种类及其含量是评价白兰地品质高低的一个重要指标[6]。不同品种酿制的白兰地香气成分千差万别，相同品种酿制而成的白兰地香气成分也会受到酿酒原料、栽培条件、发酵工艺、蒸馏工艺以及橡木桶陈酿等多种因素的影响[7]。目前，关于白兰地香气成分的研究较多[8-10]。如程显好等[11]研究不同酵母菌对白兰地挥发性成分的影响，通过测定葡萄汁发酵前后以及葡萄酒蒸馏前后成分的差异，检测到35种挥发性成分，发现不同酵母会影响白兰地的挥发性成分。姜忠军[12]研究不同的酿酒品种及酿酒酵母对发酵过程中的有机酸、pH、香气成分的影响，发现不同酵母对白兰地香气和感官有不同的影响。白玉霓作为酿造白兰地的优良葡萄品种，在烟台地区大面积种植。本研究采用顶空固相微萃取-气质联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME/GC-MS）对3种不同酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的白玉霓白兰地挥发性成分进行分析，比较3种不同酿酒对白兰地挥发性成分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白玉霓葡萄、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254、QA23、FC9：烟台张裕集团有限公司。

NaCl（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；3-辛醇（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

QP2010SE气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪：日本岛津公司；DB-Wax型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；57328-U萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PSMS）：美国Supelco公司；固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）手动进样手柄：美国Supelco公司；DF-101SZ恒温加热磁力搅拌器：巩义市科瑞仪器有限公司；XLD夏朗德蒸馏器：山东盛泉泵业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白兰地的制备

葡萄原料的处理：对白玉霓葡萄进行除梗、破碎、压榨，取葡萄汁（糖度为138 g/L）分别放入3个20 L的玻璃罐中。葡萄处理过程中添加适量干冰降温以减少氧化，且不添加SO2。

酵母活化：将一定量酵母放入烧杯中，加入10倍酵母质量的37 ℃去离子水，放入37 ℃的恒温水浴锅中活化15 min，在逐步加入少量的葡萄汁，酵母活化液降至温度与葡萄汁温差在10 ℃以内。酵母接种量为0.2 g/L。

原酒发酵：18～20 ℃控温发酵，发酵过程中每隔12 h监测发酵液的温度和比重。待发酵液的比重＜0.995、残糖≤2 g/L，发酵结束。进行澄清倒罐，得到原汁白兰地原酒。

蒸馏：采用夏朗德壶式蒸馏锅进行二次蒸馏。第一次蒸馏待馏出液酒精度降至1%vol以下时，得到粗馏白兰地，蒸馏酒精度大约28%vol～30%vol左右。将粗馏原白兰地进行二次蒸馏，去酒头（约占酒精总含量的1%），待馏出液酒精度降至55%vol以下时停止蒸馏，获得的酒身即为原白兰地，酒精度68%vol～70%vol左右。

1.3.2 HS-SPME/GC-MS分析

HS-SPME进行预处理：取待测样品，用蒸馏水或乙醇将样品乙醇含量稀释至10%vol。准确量取5 mL 10%vol的白兰地样品稀释液于20 mL萃取瓶中，加入2.0 g NaCl，再加入3-辛醇（质量浓度为0.818 g/mL）作为内标物。将待测样品瓶放入带有磁力搅拌的50 ℃恒温水浴锅中，调整转速为500 r/min，预平衡10 min，将萃取头插入萃取瓶中，萃取30 min。萃取结束后，并迅速插入气相色谱的进样口中，解吸5 min。

GC条件：进样器温度250 ℃，色谱柱为DB-Wax型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；检测器温度为220 ℃，载气为高纯氦气（He），流速为2 mL/min。分流进样，分流比为1∶5。程序升温条件：初始温度40 ℃，保持2 min，6 ℃/min升温至100 ℃，5 ℃/min升温至200 ℃，保持10 min，溶剂不延迟。

MS条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度240 ℃，扫描方式为全扫描，扫描范围为30.00～500.00 amu。

定性分析：将GC-MS检测的未知化合物的图谱与美国国家标准与技术研究院（national insititute of standards and technology，NIST）谱库II并结合文献报道的保留指数（retention index，RI）进行比对定性。

定量分析：采用3-辛醇作为内标，进行半定量法分析。按照如下公式计算各组分含量：

1.3.3 统计分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS25.0软件单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）对数据进行处理和分析。利用Origin 8.5软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同酵母白兰地挥发性成分分析

采用酵母D254、QA23、FC9发酵、蒸馏得到的白兰地样品依次编号为D、Q、F。利用GC-MS测定3种白兰地的挥发性成分，结果见表1。

表1 不同酵母酿造白兰地中挥发性成分GC-MS分析结果Table1 Results of volatile components in Brandy brewed by different yeasts analysis by GC-MS

续表

由表1可知，总共检测到69种主要成分，其中酯类29种、醇类13种、萜烯类8种、缩醛类7种、醛酮类5种、芳香类4种、有机酸类2种以及其他类1种。酯类和醇类物质是挥发性成分中主要的物质，占总挥发性化合物总量的60%以上。

酯类物质是白兰地挥发性成分种含量最丰富的物质，是由酸类物质和醇类物质在蒸馏过程中通过一系列的酯化反应生成的[13]。D白兰地中检测到16种酯类物质，总酯总量为804.58 mg/L；Q白兰地中检测到26种酯类物质，总酯含量为2 751.00 mg/L；F白兰地中检测到26种酯类物质，总酯含量为2 614.44 mg/L。3种白兰地中含量最多的酯类分别为壬酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯，同时这5种物质也是白兰地中骨架香气中比较重要的几种酯类物质。除辛酸乙酯，其余4种酯类物质含量，D与Q、F白兰地有显著差异性（P＜0.05）。乙酸异丁酯、辛酸丙酯、丁酸乙酯这3种酯类物质含量在Q和F白兰地中比较丰富，但在D白兰地中未检测到。壬酸乙酯是3种白兰地中含量最高的酯类物质，也是白兰地的骨架香气之一[9]。壬酸乙酯具有水果味，芳香带甜，有脂肪臭[14]。

醇类一般是葡萄原料在发酵的过程中，通过酵母的发酵代谢使发酵汁中的糖转化为醇，然后通过蒸馏过程，进入到原白兰地中。D、Q、F白兰地均检测到10种醇类物质，总醇含量依次为472.4 mg/L、791.50 mg/L、718.99 mg/L。在3种白兰地中，共有7种醇类物质：1-丙醇、2-甲基丙醇、1-丁醇、4-甲基-1戊醇、3-甲基-1-戊醇、正己醇、正辛醇。在共有7种醇类物质中，去除1-丁醇、4-甲基-1戊醇和3-甲基-1-戊醇这3种醇类物质，其余4种醇类在不同的白兰地中均有显著性差异（P＜0.05）。这7种醇类物质，是白兰地香气组成中非常重要的几类化合物，也是构成白兰地骨架香气的一部分[9-10，15]。对于单个化合物来说，D白兰地中醇类含量最多的物质依次是：2-甲基丙醇（251.88 mg/L）、1-丙醇（143.14 mg/L）和正己醇（48.86 mg/L）。Q、F白兰地中醇类物质含量最多的化合物依次是：1-丙醇、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和正己醇。2-甲基丙醇在Q、F白兰地中检测到，并未在D白兰地中检测出来。

萜烯类物质也是构成白兰地香气的重要组成成分，主要来源于葡萄本身，通常以苷的形式存在，在发酵过程中被游离出来，然后蒸馏进入白兰地[16]。D白兰地检测到8种萜烯类物质，萜烯类总含量为49.52 mg/L；Q和F白兰地均检测到4种萜烯类物质，萜烯类总含量依次为是16.22 mg/L、14.77 mg/L，D白兰地中萜烯类总含量是Q、F白兰地中的3倍。大马酮、紫罗兰酮、TDN、1-萜品醇这4种萜烯类物质是在3种白兰地中可以检测到。但D白兰地中这4种萜烯类物质含量与Q、F白兰地有显著性差异（P＜0.05）。紫罗兰酮的含量在D白兰地中最多（14.91 mg/L），占总萜烯类化合物总含量的30.11%。大马酮在Q和F白兰地中的含量是最多的，分别占总萜烯类化合物的60.29%、63.37%。大马酮有蜂蜜的香味，对白兰地的香气有重要贡献[9]，也有研究报道大马酮对葡萄酒的香气有重要影响[17]。乙酸松油脂、里那醇、（E）-橙花叔醇、香茅醇这4种萜烯类物质仅在D白兰地中检测到，未在其余2种白兰地中检测到。1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘在葡萄酒中呈现汽油的味道[18]，但在白兰地中也有检测到[9]，且是作为白兰地骨架香气成分之一。

白兰地中的有机酸类物质也是构成白兰地香气的一部分，其主要来源于葡萄本身，经过酵母的发酵过程，随着蒸馏而进入到原白兰地中。

D、Q、F白兰地中均检测到2种有机酸类化合物—辛酸和癸酸，总酸含量依次为28.51mg/L、26.55mg/L、13.37mg/L。根据研究报道，辛酸和癸酸的产生主要来自于葡萄发酵过程中醛类物质的氧化，其浓度主要取决于未发酵葡萄汁的初始发酵条件[19]。癸酸（21.52 mg/L）在D白兰地中含量最多，占总酸含量的75.51%。在Q、F白兰地中，酸类成分化合物含量最高是辛酸，各占64.91%、78.93%。癸酸在3种白兰地中的含量差异性显著（P＜0.05）。在本次实验中，3种白兰地产生酸的含量比较低，对白兰地香气的影响可以忽略不计。

醛酮类物质是构成白兰地整体香气不可或缺的重要组成部分。D、Q、F白兰地中均检测到4种醛酮类物质，总醛酮含量依次为1 521.12 mg/L、1 315.21 mg/L、1 257.3 mg/L。异丁醛、乙醛和庚醛是3种白兰地共有醛酮类化合物，也是3种白兰地醛酮类物质含量最丰富的化合物。在D白兰地中检测出上述3种醛酮类化合物的含量与Q、F白兰地中的含量有显著性差异（P＜0.05）。辛醛在Q、F白兰地中检测到，并未在D白兰地中检测到。癸醛在D白兰地检测到，但并未在Q、F白兰地中检测出来。庚醛是在3种白兰地中醛酮类化合物含量最高（含量依次为1 404.28 mg/L、1 203.72 mg/L、1 150.72 mg/L）。相关研究表明，白兰地中的醛酮类化合物可能来源于葡萄原料，又有可能来源于酿造白兰地的过程中。但这些醛酮类化合物对白兰地的风味有重要影响[20]。

D、Q、F白兰地中均检测出4种芳香类物质，总芳香类含量依次为96.80 mg/L、45.47 mg/L、43.02 mg/L。这3种白兰地中的芳香类物质在种类上并未有差异性，主要表现在芳香类化合物含量的差异性。3种白兰地中检测到芳香类物质：乙酸2-苯乙酯、苯甲醛、苯乙醇和3,4,4a,5,6,7-六氢-1,1,4a-三甲基-2（1H）-萘酮。在D白兰地检测出的4种芳香类化合物含量与Q、F白兰地有显著差异性（P＜0.05）。乙酸2-苯乙酯在3种白兰地中的含量是最高的，其次是苯乙醇。2-乙酸苯乙酯和苯乙醇具有淡雅细腻的玫瑰花香[21-22]，有研究认为2-乙酸苯乙酯对白兰地呈现玫瑰花香起主导作用，也有研究认为苯乙醇起主要的作用[23]。苯甲醛具有典型水果的香气，也是白兰地香气非常重要的芳香类化合物[10]。

D、Q、F白兰地均检测出7种缩醛类化合物，总缩醛类含量依次为687.53 mg/L、799.26 mg/L、768.76 mg/L。缩醛类物质与醛酮类物质类似，既可能来源于葡萄本身，也可能在白兰地的生产过程中产生，又有可能在陈酿的过程中由其他的物质转化而来，这些成分同样对白兰地的风味有着不可代替的作用，是构成白兰地前香的重要组成部分[10]。从单个化合物上来说，1,1-二乙氧基乙烷在3种白兰地中的含量是最多的，分别占总缩醛类含量的59.38%、49.55%、49.58%。D、Q、F白兰地均检测到1种含硫化合物—二甲基硫。二甲基硫在D白兰地中含量最高（33.86 mg/L），其次是在F白兰地（25.41 mg/L），最后是Q白兰地（10.59 mg/L），在3种白兰地中具有显著性差异（P＜0.05）。含硫化合物由于低阈值以及独特的香气特征，目前已有相关的研究报道。如糠硫醇是芝麻型白酒中具有芝麻香气特征的关键成分[24-25]。

2.2 挥发性成分的主成分分析

对3种不同酵母酿制的白兰地主要的挥发性成分进行主成分分析，结果见图1。由图1可知，PC1和PC2对总方差的解释率分别为72.1%和12.7%，前两个主成分对初始数据总方差的解释率为89.8%，可以体现不同酿酒酵母酿造的白兰地香气成分信息。

图1 不同酵母酿造白兰地样品（A）及其挥发性成分（B）的主成分分析结果Fig.1 Principal component analysis results of brandy samples (A)brewed by different yeasts and volatile components (B)

3种不同酵母酿制的白兰地样品的主成分分析见图1。由图1A可知，由不同酵母酿制的白兰地分布在不同的象限。D白兰地样品集中的分布在横轴的负半轴，Q和F白兰地样品分散的分布在横轴的正半轴。由此可见，以D254为酵母品种酿制的白兰地可以与QA23、FC9型酵母白兰地有明显的差异。而QA23型酵母与FC9型酵母没有明显的差异性。

由图1B可知，乙酸异丁酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸丙酯、异辛醇等这些化合物位于PC1的正半轴上，参考图1A可知，这些化合物酵母QA23和FC9中的含量比较多。乙酸异戊酯、大马酮、紫罗兰酮、乙酸2-苯乙酯、苯乙醇、1-丙醇、2-甲基丁醇这些化合物位于PC1的负半轴，由图1可知，这些化合物在酵母D254中的含量比较多。

3 结论

通过不同酵母发酵酿造得到3种不同的白兰地，利用HS-SPME与GC-MS方法对白兰地中的挥发性成分进行了定性、定量的检测，总共得到69种挥发性成分，包括酯类29种、萜烯类8种、缩醛类7种、醛酮类5种、芳香类4种、醇类13种、有机酸类2种以及其他类1种。酵母D254产生的萜烯类、醛酮类、有机酸类和芳香类含量较高。酵母D254在本次实验中产生的酸类物质含量虽然是最多的，但其相对含量比较低，所以并不会给白兰地带来不愉快的气味。酵母QA23产生的酯类、醇类和缩醛类含量较高，白兰地香气浓郁且复杂，并且壬酸乙酯的含量在酯类物质中含量最高，具有芳香水果味，是构成白兰地骨架香气的关键成分。酵母FC9产生各类挥发性化合物含量比较均衡。

对不同酵母品种（D254、QA23、FC9）酿制的白兰地中挥发性成分进行主成分分析，结果表明，选用D254型酵母与QA23、FC9型酵母有明显的差异性。但对于QA23型与FC9型酵母，二者之间的差异性不明显。

总的来说，本次实验通过对3种不同酵母（D254、QA23、FC9）对白兰地挥发性香气成分的研究，可以揭示出不同酵母的特点，根据其酵母的特点，酿造出高品质的白兰地。