生草对花椒园土壤养分及微生物丰度的影响

李佩洪, 曾攀, 龚霞, 唐伟, 陈政

四川省植物工程研究院，四川 资中 641200

长期以来，花椒栽培以清耕为主要的栽培方式，椒园物种单一，生态系统简单，其生产特征是土壤肥力主要依赖于化肥的不断投入，病虫害防治完全依赖化学农药，这种生产方式导致椒园生态系统生物多样性降低、病虫害大规模集中爆发、土壤酸化、水土流失、环境污染等一系列生态环境问题，最终导致花椒园产量下降，花椒农残、重金属含量超标，市场竞争力降低。因此构建生态化的生产体系，保障花椒园良好的生态环境，生产无公害、绿色、有机产品，促进产业健康高效持续发展，已成为花椒生产中需要重点解决的问题之一。

生草栽培是一种现代化的果园管理模式，在发达国家应用较多，我国在苹果、梨树、葡萄上进行了广泛的研究[1-3]，在花椒上的研究处于起步阶段，研究发现，种植三叶草可以提高花椒林土壤含水量、林内空气温度、蒸腾速率[4,5]，花椒林下种草可有效减轻雨水对地表的溅蚀作用，拦蓄地表径流达30%以上[6]，但是也有研究表明花椒林中花椒在与白茅等杂草的竞争中处于劣势，杂草与花椒树争肥严重[7]。花椒属于浅根性树种，其根系主要分布在0~40 cm土层，生草对土壤养分及土壤微生物组成的影响将直接影响花椒根系的生长和其对养分的吸收，因此本文就生草对花椒林土壤养分及土壤微生物组成的影响进行了研究，以期为花椒林下生草模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验地位于资中县银山镇朱家场，建园已5年的青花椒园。选择白三叶、自然生草[2,3,8]开展试验。2019年3月，选择同一块地，将试验分为3个区，分别为白三叶区，自然生草区（杂草），对照区（清耕区），各区域200 m2。采用行间生草模式，生草带和树基距离 0.5 m，每侧保留 0.5 m 清耕保护带（除草布覆盖），生草带宽2 m。播前要精细整地，除净杂草，整地时不能深翻，以免对花椒根系造成严重影响。整地同时施稀释后的沼液，白三叶萌发长出3~5片叶子后只进行水分管理。其他青花椒树正常施肥管理3个区域同时进行，不再对白三叶区域额外进行管理。

1.2 野外采样

生草第 1年8月底在各标准地内采用蛇形法布置15个采样点，每个采样点分层取 0~60 cm（20 cm为一层）土样，每层混合后取样装入灭菌塑料袋。将带回实验室的土样分成两份，一份进行土壤养分的测定，一份进行微生物的检测。

1.3 土壤养分测定

总氮：NY/T53-1987土壤全氮测定法（半微量开氏法）；总磷：NY/T88-1988土壤全磷测定法；总钾：NY/T87-1988土壤全钾测定法；有效铁：NY/T890-2004土壤中有效态锌、锰、铁、铜含量的测定 二乙三胺五乙酸（DTPA）浸提法；有效钙：NY/T296-1995土壤全量钙、镁、钠的测定；有效硼：NY/T149-1990 土壤有效硼测定方法。铵态氮、速效磷、速效钾、有机质按浙江托普云农土壤养分测定使用说明书测定，说明书版本V11.2.4。

1.4 土壤微生物测定

主要包括以下步骤：微生物组总DNA提取—目标片段PCR扩增—扩增产物磁珠纯化回收—扩增产物荧光定量—测序文库制备—上机进行高通量测序，由上海派森诺生物技术股份有限公司完成测定。仪器与设备包括pH计，酸式滴定管，紫外可见分光光度计TU-1901，原子吸收分光光度计TAS-990F，电感耦合等离子体发射光谱仪 Optima 8000，土壤养分速测仪TPY-16A。

数据库：细菌或古菌的16S rRNA基因默认选用Greengenes数据库)，也可选用Silva数据库；真核微生物18S rRNA基因默认选用Silva数据库；真菌ITS序列的默认选用UNITE数据库；功能基因或其他需求使用本地化的nt数据库进行注释

测序：调用 qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列；然后通过qiime dada2 denoise-paired 调用 DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体。以上步骤针对每个文库分别进行分析。完成对所有文库的去噪后，合并ASVs特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs。

2 结果与分析

2.1 生草对土壤水分与养分的影响

生草降低了花椒园土壤的水分含量，以清耕为对照，白三叶种植区平均降低了20.17%，自然生草区平均降低了21.99%。并且土层越浅，降低的越多：在0~20 cm土层，白三叶种植区降低了39.22%，自然生草区降低了29.77%，在20~40 cm土层，白三叶种植区降低了18.67%，自然生草区降低了29.18%，在40~60 cm土层，差异不大（见表1）。

表1 土壤养分测定结果Tab.1 Result of soil nutrients

生草增加了花椒园土壤的有机质含量，白三叶种植区0~60 cm土层有机质平均含量为清耕区的1.89倍，自然生草区为清耕区的2.27倍。白三叶种植区土壤有机质增加主要在0~20 cm土层，自然生草区在各土层均明显增加。

2.2 生草对土壤营养元素的影响

生草对花椒园土壤营养元素的含量影响较大，主要对土壤中的全氮、磷、钾，速效氮、磷、钾，以及花椒生殖生长过程中需求较多的钙、硼进行了测定（见表1）。各土层平均值显示，种植白三叶增加了土壤中全钾、有效钾、有效硼的含量，降低了土壤中总氮、总磷、铵态氮、有效磷、钙的含量，其中铵态氮、有效磷下降明显，分别较清耕区减少28.61%和15.69%。自然生草增加了土壤中总磷、全钾、有效钾、有效硼的含量，降低了土壤中总氮、铵态氮、有效磷、钙的含量，其中总磷较清耕区增加了29.57%，有效钾增加了16.59%。在0~20 cm土层，白三叶种植区总氮、总磷、全钾、铵态氮、有效磷、有效钾、钙、硼均低于清耕区，自然生草区土壤总氮、铵态氮、钙、有效硼含量低于清耕区，而总磷、全钾、有效磷、有效钾含量高于清耕区。在20~40 cm土层，白三叶种植区土壤总磷、全钾、有效钾、钙、有效硼含量高于清耕区，土壤铵态氮、有效磷含量低于清耕区，自然生草区土壤中总氮、铵态氮、有效磷含量低于清耕区，而总磷、全钾、有效钾、钙、有效硼含量高于清耕区。在40~60 cm土层，白三叶种植区土壤总磷、全钾、铵态氮、有效钾、有效硼含量高于清耕区，总氮、有效磷、钙含量低于清耕区，自然生草区土壤中总氮、总磷、铵态氮、有效钾、有效硼含量高于清耕区，而全钾、有效磷、钙含量低于清耕区。

2.3 土壤微生物测定结果

对每个样本的测序量进行统计，结果如表2所示。图1表示每个样本中的微生物群落在各分类水平的具体组成。由图可知，clover10和weeds10在0—20 cm土层的土壤微生物的分类单元数明显高于CK10，其他各个试验区不同土层厚度微生物分类单元数差异不大，说明生草明显提高了表层土壤微生物的种类。其主要原因与生草增加了土壤中有机残体的量有关，土壤微生物的主要营养来源是植物有机残体，其数量很大程度上与有机残体含量成正相关。

图1 各水平微生物分类单元数统计图Fig.1 Statistical diagram of the number of microbial classification unit at each level

表2 每样本测序量统计表Tab.2 Statistical result of sequencing quantity per sample (tag)

由图2可知，在属这个水平上，生草区域包括白三叶区域（clover），自然生草区域（weeds）其微生物丰度都显著高于清耕区域。以清耕为对照，生草区域微生物的种群结构发生了显著变化：白三叶区域其Fusarium、Mortierella、lentinula的相对丰度显著减少，Talaromyces、Acremonium和pseudorobillarda的相对丰度显著增加；自然生草区域penicillium、Fusarium的相对丰度显著增加，Mortierella、lentinula的相对丰度显著减少。

图2 属水平物种的相对丰度图Fig.2 Relative abundance diagram of species composition at genus level

3 讨论

根据测定结果，以清耕为对照，生草对土壤水分的消耗较大，并且土层越浅，消耗的越多。生草对土壤养分的影响主要集中土壤表层：在0~20 cm土层，白三叶试验区土壤测定指标中的水分、总氮、总磷、全钾、铵态氮、有效磷、有效钾、钙、有效硼的含量均低于清耕，说明种植白三叶对土壤养分有一定的消耗，与花椒树根系存在养分竞争。自然生草区水分、总氮、铵态氮、钙、有效硼的含量低于清耕区，但是总磷、全钾、有效钾、有效磷含量高于清耕区，自然生草区中杂草与花椒树主要在水分和氮肥之间存在养分竞争，杂草对土壤磷、钾含量有提高作用。白三叶试验区有机质含量是清耕区的1.89倍，自然生草试验区有机质区含量是清耕区的2.27倍，说明生草显著提高了土壤有机质的含量，这对改善土壤微生态有积极作用。李尚玮[9]研究生草6年后苹果园土壤肥力变化，结果表明相比于对照，白三叶能显著（P<0.05）提高土壤全氮、速效氮、硝态氮、铵态氮和有机质的含量，自然生草对提高速效磷含量的效果最好。李承想[10]研究了种植白三叶2年的枣园土壤水分及土壤养分含量各指标均高于清耕；吴佳[4]，曾艳琼[11]研究得出林间生草可以提高土壤的水分含量，起到涵养水源的作用。这与本文的研究结果不一致，原因可能是本文生草时间较短（3月—8月），草种从萌芽到前期生长对土壤水肥的需求较高，且为了尽快实现对土壤的全覆盖，生长过程中没有进行刈割处理（绿肥还田）。因此，花椒林下种草，前期可能存在与花椒根系争肥、争水的效应，可采取定期刈割等方式抑制草根系功能，降低其对水肥的吸收，减小其对花椒根系的影响，同时可以增加土壤有机质含量。

生草对土壤微生物的种类和丰度的影响也主要集中在土壤表层（0~20 cm），这与生草对土壤养分的影响一致。生草明显提高了表层土壤微生物的种类，也改变了土壤微生物的种群结构，花椒林下种植白三叶显著降低Fusarium的丰度，说明种植白三叶对土壤中Fusarium有一定的抑制作。Fusarium是人类发现的最重要的植物病原菌之一，它通过浸染青花椒根系，使青花椒根系腐烂，造成青花椒整株死亡，在高温高湿的夏季高发。白三叶区域Talaromyces在10~20 cm土层相对丰度很高，Talaromyces可以将土壤中的难溶性或不溶性磷转化成可溶性磷，苏辉兰、莫雪雪[12]以广西钟山县贡柑果园的土壤为试材，从贡柑果园土壤中筛选出可以将难溶性或不溶性磷转化成可溶性磷的高效解磷菌；根据菌落形态特征、18S rDNA同源性分析，NCBI数据库对比分析等研究，初步鉴定为黄丝曲霉。在40~60 cm土层，白三叶区域Acremonium相对丰度显著高于清耕和自然生草区域，Acremonium对土壤中的有害菌有抑制作用，中国科学院华南植物园姚磊，徐良雄[13]等对枝顶孢属真菌的抑菌活性及其代谢产物进行了研究，研究表明枝顶孢属真菌其固体发酵物乙醇提取物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。陈丽维，敖敬群[14]等从深海海底泥中分离出一株抗致病真菌的菌株，经鉴定为Acremonium真菌。在自然生草区域，penicillium、Fusarium的相对丰度较高，penicillium为腐生菌，常见于腐烂的有机体上，也可造成柑橘、苹果等的青霉病，对花椒树及果实未见有害报道。因此，花椒园区生草管理中可以考虑种植白三叶。