合江佛手挥发油靶向VEGF/VEGFR信号通路抗U87细胞肿瘤新生血管的生成

韩江云，陈晓霞，阳丽娟，刘睿涵，杨文娅，张丹

（1.西南医科大学附属中医医院，四川泸州 646000）（2.西南医科大学药学院，四川泸州 646000）（3.四川中医药高等专科学校临床医学系，四川绵阳 621000）

神经胶质瘤是中枢神经系统常见的占位性病变，恶性程度较高，呈易浸润性生长，预后不佳，目前发病率与致死率均是临床上最高的颅脑肿瘤之一[1,2]。目前，神经胶质瘤发病和进展的分子机制尚不完全清楚，但含丰富的新生血管，血管生成能明显促进胶质瘤的生长及远处转移[3]。研究证实VEGF（vascular endothelial growth factor血管内皮生长因子）又称血管通透因子，在正常人脑组织中低表达，但在Ⅰ~Ⅱ级人神经胶质瘤患者脑组织中异常过度表达，同时也高水平表达于多形性胶质瘤母细胞瘤[4]。VEGF-受体（VEGFR）家族主要包括fms样酪氨酸激酶受体VEGFR-1（fms-like tyrosine，flt-1）、胎儿肝激酶插入区受体 VEGFR-2（Kinase insert domain-containing receptor，KDR）及表达诱导淋巴内皮细胞的VEGFR-3（flt-4）等，它们均具有酪氨酸激酶活性[5]。许多研究证实[6,7]，VEGF/VEGFR 在脑肿瘤微血管生成过程中发挥着关键作用，如果肿瘤体积超过1~2 mm3，会不断释放VEGF、bFGF（basic fibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子）等血管调控因子，其中VEGF可与/VEGFR如flt-1、KDR结合，能明显促进内皮细胞的增殖与迁移，最终形成肿瘤新生血管，因此，VEGF/VEGFR信号通路一直是抗肿瘤血管生成重要的分子靶标。

近年来，中药有效部位或成分凭借其毒性低，且具有多靶点、多途径、多环节等优势，逐渐成为抗肿瘤重要的研究热点之一[8]。中药挥发油是通过超临界流体萃取或蒸馏等从中药材中提取的挥发成分，许多中药挥发油具有明显的抗肿瘤活性，如抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的肉桂、白介子、葡萄柚、洋葱等植物挥发油[9,10]。此外，定心藤、檬香茅、樟油、野西瓜等中药挥发油，还能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长[11]。作为药食同源的合江佛手是四川合江道地中药材，种植面积较大，具有很好的药用和经济价值[12,13]。合江佛手挥发油是西南医科大学张丹课题组采用水蒸气蒸馏法，从合江佛手中提取的主要有效部位，主要成分柠檬烯和γ-松油烯。研究证实，柠檬烯具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性，γ-松油烯具有抗肿瘤、抗氧化、抗真菌等作用[14]等。本研究采用CCK-8筛选合江佛手挥发油体外敏感的肿瘤细胞，同时复制裸鼠神经胶质瘤U87细胞移植瘤模型，观察合江佛手挥发油对荷瘤裸鼠肿瘤生长、血管生成指标MVD（microvessel density微血管密度）及VEGF、flt-1、KDR蛋白表达的影响，旨在系统评价合江佛手挥发油的抗肿瘤活性，阐明其抗神经胶质瘤血管生成的分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

合江佛手：合江佛手购自 GAP认证的泸州合江正海中药饮片公司，由西南医科大学生药鉴定教研室税丕先教授进行药材鉴定。RPMI1640培养基、胎牛血清、CCK8（cell counting kit-8）及PV法兔二抗试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；贝伐单抗注射液（Bevacizumab，Avastin）：Roche公司，批号：B9387。兔抗鼠VEGF多克隆抗体、兔抗鼠Flt-1、KDR单克隆抗体、CD34单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞株

选择 4株人肿瘤细胞进行体外抗肿瘤活性评价，包括神经胶质瘤细胞（U87）、乳腺癌细胞（MCF-7）、肺腺癌细胞（A549）、肝癌细胞（HepG2），均购自 CCTCC（中国典型培养物保藏中心），采用RPMI1640细胞培养基，在西南医科大学药学院实验室长期常规培养、传代、保存。

1.3 实验动物

雄性SPF级BALB/c-nu裸鼠55只，5~6 w龄，体重18±2 g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SYXK（川）2018-24。饲养于西南医科大学实验动物中心，SPF级动物实验室，40%~70%的相对湿度，温度控制在20~25 ℃，各组祼鼠自由摄食饮水。

1.4 试验方法

1.4.1 合江佛手精油的提取与GC-MS分析

合江佛手精油的提取：合江佛手购自GMP认证的泸州合江正海中药饮片公司，由西南医科大学税丕先教授进行药材鉴别。首先冷冻干燥处理，然后粉碎过60目筛（Φ200×50mm）。提取时准确称取合江佛手粉100 g（精确至0.01 g），采用水蒸气蒸馏法提取。收集含少量水的精油，3000×g离心10 min后脱水处理，最后加入无水硫酸钠适量制备成合江佛手精油，4 ℃下用棕色密封瓶保存、备用。

合江佛手精油成分分析采用GC-MS处理，得总离子流图见图1，定量分析采用峰面积归一化法。

图1 合江佛手精油的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of essential oil of volatile oil of Hejiang bergamot

1.4.2 体外抗肿瘤活性筛选

体外实验选择4株人肿瘤细胞（U87、MCF-7、A549、HepG2细胞），各肿瘤细胞培养至指数生长期后，细胞悬液浓度调整为5×104/mL，按照每孔90 μL种板，待细胞贴壁24 h后加药。合江佛手挥发油先用吐温溶解，再用NS稀释为不同浓度，每孔加入10 μL，最终受试药物浓度分别为 31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，各浓度均设 3 复孔。阴性对照加10 μL培养基，阳性对照为10 μL顺铂。药物干预48 h后每孔加入检测试剂CCK-8 10 μL，孵育1 h后采用酶标仪，在450 nm波长下检测每孔吸光度（A）。以吸光度值计算增殖抑制率（%），绘制浓度-抑制率曲线，半数抑制浓度 IC50计算采用 IC50软件进行。

1.4.3 体内对U87细胞裸鼠移植瘤生长的影响

体内实验选择处于指数生长期的神经胶质瘤细胞U87细胞，调整细胞浓度为5×106/mL，按0.2 mL接种于3只裸鼠右侧皮下，待形成明显瘤组织后，无菌条件下剪成约1.5 mm3大小的瘤块，然后分别接种于52只裸鼠右侧腋窝皮下。筛选已形成瘤块、且瘤径≥50 mm3的裸鼠，按照随机原则分为5个实验组，阴性对照组（等体积生理盐水灌胃给药）、阳性对照组（贝伐单抗注射液，5 mg/kg腹腔注射给药）和合江佛手挥发油低、中、高三个剂量组（12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg，灌胃给药）。参考抗肿瘤药效学研究指导原则，给药周期设为30 d，其中每周给药5 d，停药2 d。实验中每3 d用游标卡尺准确测量裸鼠移植瘤瘤径1次，分别计算3个肿瘤生长评价指标：肿瘤体积（TV）、相对肿瘤体积（RTV）及相对肿瘤增殖率（T/C %）。实验结束后处死动物，剥取瘤组织，称瘤重。计算公式如下：

（1）TV（tumor volume）=1/2×a×b2，其中 a、b为祼鼠移植肿瘤的长径和宽径；

（2）RTV（relative tumor volume），其中V0为初次给药时（d0）所测得的移植瘤体积，Vt为每三天测量的移植瘤体积；

疗效评价标准[3]：T/C%（相对肿瘤增殖率）≤60%且有统计学差异为有效；如T/C %> 60%则为无效。

1.4.4 裸鼠U87细胞移植瘤MVD测定

取裸鼠移植瘤组织，依次切片、脱蜡、水化，按免疫组化实验步骤进行。CD34单克隆抗体按照1:100稀释，滴加CD34单抗后4 ℃孵育过夜，滴加二抗。阴性对照用磷酸盐缓冲液代替CD34单抗。采用DAB染色，光镜下观察结果。先在低倍如40倍找到“热点”（视野下在染成棕色条索状的血管内皮细胞/血管内皮细胞群，只要与邻近肿瘤细胞、血管内皮细胞或其它结缔组织细胞分开，就视为一个微血管，也就是“热点”)。然后在200倍视野下，找到祼鼠U87细胞移植瘤区域内，“热点”分布最密集的5个区域，通过400倍光镜计数选取的5个区域，计算平均值，作为裸鼠U87移植瘤的微血管密度MVD。

1.4.5 Western blot检测瘤组织中 VEGF、flt-1及KDR的表达

各组祼鼠U87细胞移植瘤组织匀浆，经组织裂解液裂解后离心提取总蛋白。蛋白含量测定采用BCA法，然后SDS-PAGE胶垂直电脉，转膜、封闭。VEGF、flt-1、KDR及β-actin一抗按照1:1000稀释，滴加一抗后孵育1 h，再加入PV法兔二抗4 ℃孵育1 h。加入化学发光液（1:1的溶液A和溶液B），完全覆盖PVDF膜，采用凝胶成像系统曝光显影、拍照，蛋白条带分析采用专业的Image Lab 3.0与β-actin内参比较，计算祼鼠移植瘤组织中VEGF、flt-1及KDR的蛋白相对表达量。

1.4.6 统计学方法

计量资料数据以均值±标准差（±S）表示，统计学处理采用 SPSS 20.0统计学软件进行方差分析，以p<0.05为统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析

本研究通过水蒸气蒸馏法提取合江佛手挥发油，得率为0.71%；通过GC-MS测定，面积归一化法计算其精油中柠檬烯和γ-松油烯相对质量分数分别为48.46%和35.39%，结果见图1。

2.2 体外抗肿瘤活性筛选

选择4株人肿瘤细胞进行体外试验，合江佛手挥发油干预后，对U87、MCF-7、A549、HepG2等肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用，且随着浓度的增加抑制作用增强，图2为合江佛手挥发油对各肿瘤细胞的浓度-增殖抑制率曲线。根据增殖抑制率，合江佛手挥发油对 U87、MCF-7、A549、HepG2细胞的 IC50分别为82.19 μg/mL、173.99 μg/mL、215.83 μg/mL、192.87 μg/mL。

图2 体外对人肿瘤细胞的浓度-增殖抑制率曲线Fig.2 Concentration-inhibition curve of human tumor cells in vitro (n=3)

佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）属芸香科香橼的变种，因产地不同有川佛手、广佛手、建佛手、金佛手之分，但中国佛手种植面积以四川最大，其产量也最高[15]。第四次四川中药资源普查表明，川佛手主要种植区位于洪雅、夹江、石棉、峨眉、乐山、犍为、沐川、宜宾叙州区、泸州合江[16]等岷江流域及长江流域上游的山区。合江佛手作为药食同源的四川泸州道地中药材，种植面积大，药用和经济价值较大。本研究采用水蒸气蒸馏法提取合江佛手的有效部位，得到合江佛手挥发油，提取得率为0.71%，经GC-MS成分分析，主要成分为柠檬烯和γ-松油烯，分别为48.46%、35.39%[17-19]。近年来，有不少关于佛手挥发油抗肿瘤研究的报道，如邵邻相等研究证实[20]50 mg/kg的佛手挥发油对荷B16黑色素瘤小鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用，也有研究报道[21]，佛手挥发油灌胃给药后能明显抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，作用机制与阻滞细胞周期停留S期、G2/M期，诱导其凋亡有关。本研究结果显示，合江佛手挥发油体外对4株肿瘤细胞如U87、MCF-7、A549、HepG2细胞有一定的抑制作用，其中敏感性最强的是神经胶质瘤U87细胞，因此，我们后续选择了U87细胞进行体内实验研究。

2.3 体内对祼鼠U87细胞移植瘤生长的影响

祼鼠U87细胞移植瘤实验结果显示，合江佛手挥发油灌胃给药后，裸鼠 U87细胞移植瘤的肿瘤体积TV，肿瘤相对体积RTV和相对肿瘤增殖率T/C%均缓慢下降，在治疗最佳时间（d24），T/C%分别为65.22%、58.74%、51.36%。由于合江佛手挥发油中、高剂量组T/C%低于60%，且与对照组比较p<0.05或p<0.01，差异有统计学意义，提示治疗有效。结果见表1、图3~5。

图3 对裸鼠U87细胞移植瘤RTV的影响Fig.3 Effects on RTV of transplanted U87 cell in nude mice(±S, n=8)

表1 治疗最佳时间（d24）对裸鼠U87细胞移植瘤TV，RTV和T/C%的影响Table 1 Effects on TV, RTV and T/C% of transplanted U87 cells in nude mice at the optimal treatment time (d24, ±S)

表1 治疗最佳时间（d24）对裸鼠U87细胞移植瘤TV，RTV和T/C%的影响Table 1 Effects on TV, RTV and T/C% of transplanted U87 cells in nude mice at the optimal treatment time (d24, ±S)

注：d0：给药第0 d（分笼给药开始），d24：给药第24 d（实际疗效最佳时间）；与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01。

组别 剂量/(mg/kg) n TV/mm3 RTV T/C%d0 d24 Control - 6 123.49±13.62 1026.45±97.24 8.91±0.65 100 Bevacizumab 5 6 117.18±12.55 489.76±56.27** 3.87±0.29** 43.42 VO-HB 5 6 119.42±14.54 823.42±71.22* 5.81±0.37* 65.22 VO-HB 10 6 124.72±13.41 687.35±65.43** 5.23±0.35** 58.74 VO-HB 20 6 121.77±12.95 575.26±59.47** 4.57±0.39** 51.36

图4 对裸鼠U87细胞移植瘤T/C%的影响Fig.4 Effects on T/C% of transplanted U87 cell line in nude mice (±S, n=8)

神经胶质瘤是发生于神经外胚叶组织的恶性肿瘤，由于人类生存环境的不断恶化，我国神经胶质瘤发病率与致死率呈现明显的逐年升高趋势。2019年中国分地区肿瘤分布数据显示[22]，神经胶质瘤年发病率已达到5~8人/10万人，而五年生存率不足10%，仅次于肺癌和胰腺癌，为预后较差的恶性肿瘤之一。目前，我国神经胶质瘤存在早期发现较难的问题，多数患者诊断明确时已经失去早期手术机会，而化学治疗又存在毒副作用较大，不易穿透血脑屏障，且易产生多药耐药性等问题，因此，神经胶质瘤难以取得理想的临床效果。研究发现[23]，配合使用一些小分子靶向药物及中药复方，特别是中药有效部位或成分，可适当减少胶质瘤术后的转移及复发，也能延长肿瘤患者的中位生存时间。抗肿瘤药效学指导原则指出，体内抗肿瘤疗效评价标准：T/C%（相对肿瘤增殖率）≤60%且有统计学差异为有效。合江佛手挥发油25、50 mg/kg治疗组的T/C%均小于60%，且有一定的剂量依赖关系，揭示合江佛手挥发油体内也有较强的抗神经胶质瘤活性，具有较好的开发前景，有希望用于神经胶质瘤的临床的辅助治疗。

图5 治疗结束时对裸鼠U87细胞移植瘤瘤重的影响Fig.5 Effects on weight tumor of transplanted U87 cell line in nude mice at the end of treatment (±S, n=6)

2.4 对瘤组织中 MVD 及 VEGF、flt-1、KDR表达的影响

免疫组化结果表明，对照组祼鼠瘤组织呈明显的棕褐色索状，“热点”分布较多。贝伐单抗阳性组与合江佛手挥发油三个治疗组裸鼠瘤组织，“热点”稀疏分布，MVD值由对照组的63.24分别降低到30.65、46.88、40.18、36.56，与对照组比较p<0.05或p<0.01，结果图6。Western blot检测结果显示，对照组瘤组织中有大量的VEGF、Flt-1及KDR蛋白表达，贝伐单抗阳性组与合江佛手挥发油三个治疗组减少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相对表达，与对照组比较，蛋白相对表达VEGF由对照组的0.93分别降低到0.19、0.52、0.33、0.16，flt-1由对照组的0.82分别降低到0.18、0.50、0.32、0.09，KDR由对照组的0.78分别降低到0.14、0.48、0.30、0.11，p<0.01。结果见图7。

图6 对U87细胞裸鼠移植瘤组织中微血管密度的影响（×200）Fig.6 Effect on MVD in transplanted U87 cells in nude mice(×200)

图7 U87细胞裸鼠移植瘤组织中VEGF，flt-1和KDR的蛋白相对表达Fig.7 Relative expression of VEGF, Flt-1, and KDR protein in transplanted U87cells in nude mice

研究证实，缺氧耐受是肿瘤新生血管生成的启动信号，也是恶性肿瘤血管增殖、迁移及小管形成的关键促进因素。HIF-1（hypoxia-inducible factor-1，低氧诱导因子-1）是重要的血管生成调控的上游因子，参与了多种恶性肿瘤的血管生成以及其发生、发展和转移[24]。神经胶质瘤的生物学特征与其他恶性肿瘤相似，当营养需求不能被满足导致恶性肿瘤局部缺血、缺氧时，肿瘤细胞HIF-1基因被大量激活，直接激活血管内皮生长因子及其受体（VEGF/VEGFR)，从而起到促进神经胶质瘤内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，形成新生血管。VEGF-165在神经胶质瘤中优势表达，是VEGF主要存在构型，当VEGF与VEGFR结合后，通过信号转导，充分发挥生物学功能促进神经胶质瘤血管生成。迄今为止，VEGFR的5种异构受体已经被确认：VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）、VEGFR-3、NP-1和NP-2。Wojtukiewicz MZ等[25]研究发现，Flk-1受体是VEGF促进血管生成的先决条件，而应用VEGFR-2单克隆抗体如贝伐单抗，则可通过拮抗VEGF、bFGF导致的肿瘤血管生成。有研究发现[26,27]肿瘤组织微血管密度（MVD）作为肿瘤血管生成间接评价的一项重要指标，与恶性肿瘤的临床分期、病理分级、远处转移以及肿瘤预后密切有关。随着合江佛手挥发油剂量的增加，裸鼠U87移植瘤组织棕褐色条索状分布较少，“热点”稀疏，MVD值明显降低。Western blot检测结果表明，合江佛手挥发油随着药物浓度的增高而减少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相对表达，揭示抑制VEGF/VEGFR信号通路可能是其抑制人神经胶质瘤裸鼠移植瘤血管生成的重要分子机制之一。

3 结论

3.1 体外实验结果表明，合江佛手挥发油对 U87、MCF-7、A549、HepG2细胞的增殖具有较强的抑制作用，其中对人神经胶质瘤U87细胞作用最敏感。由于合江佛手挥发油体外抗肿瘤具有一定的选择性，因此，我们后续选择了U87细胞进行祼鼠移植瘤实验研究。

3.2 祼鼠U87细胞移植瘤实验结果显示，合江佛手挥发油三个治疗组裸鼠U87细胞移植瘤三个肿瘤生长的评价指标TV、RTV和T/C%明显下降，治疗最佳时间（d24）T/C%分别为65.22%、58.74%、51.36%。25、50 mg/kg治疗组的T/C%低于60%且与对照组比较有统计学差异，揭示合江佛手挥发油体内抗肿瘤为有效，具有较好的开发前景，有望临床用于神经胶质瘤的辅助治疗。

3.3 神经胶质瘤是多血管的恶性肿瘤，其生长、转移离不开肿瘤血管的生成。肿瘤血管生成与多种血管调控因子如VEGF、bFGF、PFDF等密切相关。合江佛手挥发油随着药物浓度的增高而减少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相对表达，具有抑制神经胶质瘤裸鼠移植瘤血管生成的作用。综上所述，合江佛手挥发油体内抗神经胶质瘤的分子机制可能与靶向抑制 VEGF/VEGFR信号通路，抗肿瘤新生血管生成有关。