不同种黑米储藏期中花色苷的测定及微观结构分析

唐 倩 肖华西 孙术国 林亲录 唐玮泽

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，长沙 410004)

目前对黑米中花色苷的研究主要可以分为两个方面：一是花色苷的提取纯化及其分子结构分析，二是花色苷的生物活性研究。从黑米中提取的花色苷, 除了表现出亮丽的色泽，还具有抗氧化、延缓衰老、抑菌抗炎、降血糖、降血脂、抑癌抗癌和改善视力、缓解肝功能障碍等多种生理功能，特别是矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷，对癌细胞增殖有体外抑制作用[1]，对内皮细胞的氧化应激有很好的保护作用[2]，对血管内皮生长因子诱导的生成的血管也具有保护功效[3]，在食品、医药、化妆品等方面均得到了广泛的应用。Kaneda等[4]对黑米皮提取物的生物活性研究结果表明矢车菊素-3-葡萄糖苷不仅是黑米中重要的抗氧化成分，而且具有极强的自由基清除能力并且可以保护表皮细胞免收紫外线损伤。Chang等[5]研究了黑米花色苷提取物对乳腺癌细胞的作用，结果表明黑米花色苷可通过诱导细胞凋亡和抑制血管再生的方式抑制乳腺癌细胞生长。Morimitsu等[6]研究表明从黑米中提取的矢车菊素-3-葡萄糖苷对糖尿病型白内障形成表现出了良好的抑制作用。

粮食品质变化不仅仅由于脂质、蛋白质和淀粉的影响，稻米胚乳形态结构和各种物质成分的分布特点以及结合方式是反映粮食储藏品质的重要因素[7]。稻谷在储藏过程中，微观结构上的细小变化会引起米粒内部结构的变化，从而发生相应的生理、化学变化，并最终导致稻谷的食用、加工、储藏品质发生变化[8]。丁超等[9]通过比较储藏期间稻谷、糙米及精米横截面微观结构的变化发现，所有稻米样品内部蛋白质和淀粉颗粒分别出现不同程度的聚集，颗粒结构趋于紧凑，细胞壁逐渐消失，颗粒内部组分的排列趋于凌乱。谷物储藏过程中，随着生理代谢的变化，其生理活动和营养品质都会改变，蛋白质是粮食的重要组成成分在储藏过程中蛋白质二级结构也会发生变化。杨卫梅等[10]应用傅里叶变换红外光谱技术对不同储藏年份的谷物种子进行区分研究，结果显示谷物种子随着储藏年份增加，自动峰和交叉峰的数目减少且强度减弱。赵娟红[11]采用傅里叶红外光谱对不同温度下储藏的宁乡黑猪肉蛋白质二级结构的测定得知随着储藏时间的延长，蛋白质结构趋向于从有序结构向无序结构的转变，β -折叠和β-转角的相对含量显著减少，α-螺旋相对含量和无规则卷曲相对含量显著上升。

本实验探究不同花色苷含量的黑米在储藏过程中花色苷的鉴定及各单体含量的变化及其变化规律，以及对黑米微观结构、蛋白质二级结构的观察分析，为黑米储藏机理的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粮田黑1405(黑籼黏米)、粮田黑1501(黑粳糯米)、粮田黑1301(黑粳糯米)、粮田黑1505(黑籼黏米)；芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品；甲酸；甲醇；溴化钾、无水乙醇：分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9123A型电热鼓风干燥箱，JSM-6700型扫描电镜，IRTracer-100型傅里叶红外光谱仪，API 4000型LC/MS/MS高效液相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 花色苷的鉴定及单体含量的测定

1.3.1.1 检测样品的配制

花色苷溶液的提取：在黑暗条件下，用总计15 mL甲醇：1 mol/L HCl(85：15)，用摇床3次提取0.5 g米粉，然后在4 100 g下在室温下离心15 min，清澈的上清液即为花色苷提取液。

样品溶液的配制：取不同样品的提取溶液1 mL于容量瓶中，加适量色谱级甲醇溶解，利用超声波进一步溶解后定容至刻度，再用0.2%色谱级甲酸水溶液逐级稀释多倍后进行测定，进样前使用0.45 μm的微孔滤膜滤过。

对照样品的配制：取一定量的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷化合物的标准品，将标准品化合物分别用甲酸稀释配制成5个不同浓度溶液。

1.3.1.2 色谱条件

色谱柱：TC-C18，150 mm×4.6 mm×5 μm， 柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min，检测器：二极管阵列检测器；进样量：5 μL；流动相：A为含1.0%甲酸的水溶液，B为含甲醇溶液，A+B=70+30；等度洗脱。采集波长：523 nm；采集时间：15 min。

1.3.1.3 质谱条件

电离电压：3 500 V，干燥温度：350 ℃，离子传输管温度：350 ℃。离子对信息：定量离子对：463.186：301.135(21 eV)，定性离子对：463.186：258.064(44 eV)。所有质谱数据采用Mass Hunter 8.0软件进行采集和分析。

1.3.1.4 定量分析

参照付鑫景[12]的方法采用外标法对黑米中花色苷单体进行定量。按照色谱质谱条件进样分析，每个样品重复测定3次。以标准品浓度(40～5 000 ng/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，五点外标法绘制标曲线。进行定量分析，以信噪比S/N=10时确定该方法的定量限(LOQ)，以信噪比S/N=3时确定该方法的检测限(LOD)，通过峰面积对HPLC的精密度进行实验分析。

1.3.2 微观结构的测定

黑米的微观结构的测定方法参照朱芳芳等[13]的方法，将黑米去壳后，得到糙米，再将糙米夹在开叉的镊子上，用小刀背在样品的中部施压，使其自然断裂。用小刀切下断裂部，制成3 mm厚的样品，断面向上，样品用双面胶带纸黏附于铜样台上，对断面喷金。置样品于JSM-6700型扫描电镜下观察糙米断面的背部、中部和腹部并摄影，加速电压20 kV，分别放大35倍、2 000倍和5 000倍。

1.3.3 蛋白质二级结构的测定

取一定量的充分干燥的溴化钾，放入玛瑙研钵中在钨灯充分研磨至不见晶体。称取1 mg 充分干燥过的黑米粉放入研钵中，取200 mg研磨好的溴化钾与之充分混合均匀，压制成薄片。利用傅里叶红外光谱仪进行全波段(400～4 000 cm-1)扫描，扫描次数为132次；得到的谱图通过Omnic 8.2软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑米储藏过程中花色苷的鉴定及单体含量的测定

2.1.1 黑米花色苷提取物的组分分析

对黑米中花色苷高效成分进行分析，由结果可知4种黑米的液相图基本一致，均在2.38、9.28、25.33 min三处出峰，说明4种黑米花色苷提取物在单体组成上没有差别，只是各单体的相对含量不同。利用一级质谱数据获得化学成分的准分子离子峰，确定可能分子量；根据正负离子模式下获得的多级质谱数据，获得相关结构碎片离子信息，参考相关文献报道及标准品色谱图信息，共鉴定出3种化合物，分别是芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和锦葵色素-3-葡萄糖苷，具体见表1。

表1 黑米花色苷鉴定

2.1.2 黑米储藏过程中花色苷单体的定量分析

由图1可知，4种黑米的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷含量在储藏过程中均发生了变化，但是并没有明显的随储藏时间变化的规律。值得注意的是，4种黑米中的芍药素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量在储藏前后大体呈现下降的趋势，其中就芍药素-3-O-葡萄糖苷而言，粮田黑1501从储藏前期的790.00 μg/g先下降到550.00 μg/g后又回升到700.00 μg/g，其整体下降率为11.39 μg/g；粮田黑1505的程度最大，从储藏前期的480.00 μg/g先下降到300.00 μg/g后回升到390.00 μg/g，整体下降率为18.75%。此外，粮田黑1501和粮田黑1505在储藏前后的变化程度较粮田黑1405和粮田黑1301的变化程度更大，黑米中花色苷因具有酚羟基结构

图1 黑米储藏过程中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷含量的变化

而具有抗氧化、清除自由基等活性，且花色苷含量越高，对自由基等清除能力越强，这可能说明粮田黑1501和粮田黑1505在储藏过程中清除自由基数量及能力优于粮田黑1405和粮田黑1301。

2.2 黑米储藏过程中微观结构的变化(胚乳横断面扫描电镜观察)

图2显示了4种黑米储藏过程中整体和内部淀粉颗粒结构变化。观察放大35倍扫描电镜图发现，4种黑米在储藏前期的横截面均无明显裂纹，储藏过程中横截面渐渐出现细纹，储藏后期与储藏前期横截面裂隙比较明显，其中花色苷含量较高的粮田黑1501和粮田黑1505的横截面裂隙变化较花色素含量较低的粮田黑1405和粮田黑1301的横截面裂隙变化小。观察放大1 000倍扫描电镜图发现，储藏初期，4种不同品种的黑米淀粉结构多以复粒方式存在，淀粉分子被紧密的包裹在蛋白质网络中，淀粉颗粒排列紧密，有清晰棱角分明的多面体结构，储藏过程中，4种黑米均出现不同程度的破损和坑槽，并且复粒淀粉转换为松散的单粒淀粉，出现明显的间隙和空洞，并且储藏后期可以观察到部分颗粒黏连在一起。从图2中可以观察到花色苷含量较高的粮田黑1501和粮田黑1505的淀粉颗粒黏连程度较花色素含量较低的粮田黑1405和粮田黑1301的程度低。观察放大5 000倍扫描电镜图发现，原始样品中的淀粉单体较多，淀粉颗粒形状均不光滑平坦的，呈现多面体的结构，且多排列整齐有序地裸露在外，而储藏210 d后的样品淀粉颗粒形状粗糙，相当一部分单淀粉粒形状近圆型，棱角较钝，还有一部分淀粉颗粒变得模糊不清，排列不规则，且淀粉颗粒多以复粒形式存在，被膜包裹度高。其中花色苷含量较高的粮田黑1501和粮田黑1505在储藏前后淀粉颗粒形态的变化较花色素含量较低的粮田黑1405和粮田黑1301的淀粉颗粒形态变化小。

图2 黑米储藏过程中胚乳细胞形态特征扫描电镜图

2.3 黑米储藏过程中蛋白质二级结构的变化

蛋白质二级结构是黑米品质变化的一个重要的参考性指标，目前广泛应用于分析谷物储藏过程中品质的变化，常见蛋白质二级结构主要有 α-螺旋、β-折叠结构、β-转角和无规则卷曲等结构。由图3可见，蛋白质中的酰胺Ⅰ带在红外光谱区有若干明显的吸收带，傅里叶变换红外光谱就是通过检测酰胺Ⅰ带对红外辐射的吸收频率来分析蛋白质二级结构的变化[14]。各子峰与二级结构之间的对应关系为：α-螺旋的子峰为1 650～1 658 cm-1，β-折叠为

1 610～1 640 cm-1，β-转角为1 660～1 700 cm-1，无规则卷曲为1 640～1 650 cm-1。

不同品种的黑米在不同的储藏时期，蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠结构、β-转角和无规则卷曲含量不同，具体的含量变化见图3。随着储藏时间的延长，4种黑米的α-螺旋结构和β-折叠结构含量均呈现下降的趋势，无规卷曲和β-转角含量均呈现上升的趋势，黑米的蛋白二级结构由有序状向无序态转变。其中，对于α-螺旋结构和β-折叠结构而言，粮田黑1405下降程度最大，分别由20.89%下降至5.00%，32.35%下降至20.40%；对于后者两个结构而言，粮田黑1405结构含量增加程度也最大，β-转角含量由22.75%增至31.00%，无规卷曲含量由10.00%增至19.00%。与花色苷含量高的粮田黑1501和粮田黑1505相比，花色素含量低的粮田黑1405和粮田黑1301的蛋白二级结构含量的变化更为剧烈，造成该现象的原因可能是由于花色苷含量较高的黑米可以有效地清除由于酶促反应以及氧化等产生的自由基的物质，进而能够有效地阻止脂质和蛋白质的进一步氧化，进而降低黑米蛋白氧化程度，从而显著影响黑米蛋白的结构稳定性。蔡勇建等[15]对储藏过程中米糠蛋白二级结构变化的研究发现，米糠氨基酸残基的氧化以及米糠酸败产生的脂质氧化产物会使米糠蛋白解螺旋和去折叠，会引起米糠蛋白α-螺旋和β-折叠含量下降，无规卷曲和β-转角含量增加，最终导致米糠蛋白二级结构由有序态向无序态转变。

图3 黑米储藏过程中蛋白质二级结构含量变化图

3 结论

对4种黑米的花色苷进行鉴定和分析，研究了4种黑米储藏过程中微观结构、蛋白质二级结构的变化。结果表明4种黑米的液相图基本一致，共出现3个峰，分别鉴定出是芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和锦葵色素-3-葡萄糖苷。

定量分析结果表明，4种黑米中的芍药素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量综合在储藏前后大体呈下降趋势，其中就芍药素-3-O-葡萄糖苷而言，粮田黑1501储藏前期前后的整体下降率为11.39 μg/g；粮田黑1505整体下降率为18.75%。此外，粮田黑1501和1505在储藏前后的变化程度较粮田黑1405和1301的变化程度更大。4种黑米储藏过程中整体和内部淀粉颗粒结构均随着储藏时间发生了明显的变化。其中粮田黑1405和粮田黑1301 的变化较为显著，有更清晰棱角的多面体结构的单淀粉粒形状逐渐近圆型，而粮田黑1501和粮田黑1505控制劣变的程度相对较强。

随着储藏时间的延长，4种黑米蛋白质二级结构由有序状向无序态转变，其α-螺旋结构和β-折叠结构含量均呈现下降的趋势，无规卷曲和β-转角含量均呈现上升的趋势。其中，对于前两者结构而言，粮田黑1405下降程度最大，分别由20.89%下降至5.00%，32.35%下降至20.40%；对于后者两个结构而言，粮田黑1405结构含量增加程度也最大，β-转角含量由22.75%增至31.00%，无规卷曲含量由10.00%增至19.00%。