miR-221在急性心肌梗死大鼠心肌损伤中的作用及机制

郝星 龙仙萍 王正龙

(遵义医学院附属医院心内科，贵州 遵义 563000)

急性心肌梗死(AMI)是一种因心肌极度缺血导致的急性血栓类疾病，以致最终发生血管闭塞的心血管疾病。AMI常发于老年人，发病率及致残率高，严重威胁患者的健康〔1，2〕。目前AMI发病机制尚未阐明，但心肌细胞凋亡是AMI早期的重要原因之一，是引起心肌重构及心力衰竭的重要因素之一。因此，抑制心肌细胞凋亡对于AMI的抑制非常重要〔3〕。miRNA作为内生性、序列结构在进化上高度保守的长度约为18～23 nt的一类非编码RNA分子，通过靶向结合于下游靶基因，通过调控靶基因的转录和降解，对细胞的增殖与凋亡、细胞的生长与分化等生物学行为进行参与。研究表明miRNA能特异性表达于心肌细胞中，且miRNA在AMI、心肌肥大、心律失常、心力衰竭等多种心血管疾病中异常表达〔4，5〕，其中发现miR-221在AMI患者心肌组织有较高的表达，但其机制尚未可知〔6～8〕。本研究旨在探讨miR-211在AMI大鼠心肌损伤中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验对象：选择55只雄性SD大鼠体重(200±20)g，在(23±2)℃室内模拟昼夜环境饲养，可自由饮食和饮水。试剂及仪器:兔抗人Bax、Bcl-2、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)、p-ERK1/2、GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、BCA试剂盒、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-9活性检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；Trizol 试剂盒，RT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自美国Invitrogen；miR-221抑制剂、miR-221 NC、双垂直电泳仪及配套凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司。

1.2方法

1.2.1AMI建模与给药〔3〕选取43只大鼠建AMI模型，操作过程如下：利用10%水合氯醛将大鼠进行麻醉，将大鼠的颈部和胸部毛发进行彻底消毒并剃除，切开皮肤，做1 cm直径切口，连接呼吸机设置并调整呼吸频率、潮气量、呼吸时间参数。接着以大鼠胸部左侧的第4根肋骨为手术切口，将大鼠皮肤逐层剥离，暴露出心脏，结扎冠状动脉左前降支，心电图出现ST段抬高，为AMI建模成功。40只大鼠成功建立AMI模型。随机选取建模成功的36只大鼠作为本次研究的对象，均分为AMI组、对照组及抑制组，同时选取正常大鼠12只，按照建模大鼠操作，只对冠状动脉穿线不结扎，作为假手术组。选取12只大鼠转染慢病毒空载体miR-221-NC作为对照组；选择12只携带miR-221抑制剂慢病毒作为抑制组；AMI组和假手术组隔日1次给予生理盐水，连续2 w。

1.2.2检测大鼠心脏功能 经过2 w的治疗后，麻醉大鼠，彩超检查心脏下述指标：左室射血分数(LVEF)，左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)及左室长轴缩短分数(FS)。

1.2.3Tunel法检测心肌凋亡指数(AI) 取心肌组织，石蜡包埋，切片，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、通透、PBS洗涤、反应液孵育、PBS洗涤、染色封片，显微镜下观察计算细胞凋亡率，细胞棕黄色者为凋亡细胞。

1.2.4miR-221表达检测 提取心肌组织中RNA，确保纯度满足测试后，行RNA逆转录，转录后行 PCR扩增，设计引物参照文献。35次循环。

1.2.5Caspase-3及Caspase-9活性检测 取适量大鼠心肌组织，匀浆并离心，加入胰蛋白酶裂解，离心获得上清液，按照Caspase-3及Caspase-9活性检测试剂盒说明书进行检测。

1.2.6Western印迹 Western印迹检测Bax，Bcl-2，PCNA，livin，p-ERK1/2蛋白表达。处死大鼠后取心肌组织研磨成浆，离心后加入细胞裂解液，裂解30 min，取上清液检测蛋白浓度。将蛋白样品煮沸变性10 min后，上样、电泳和转膜后，将2%BSA封闭1 h，然后一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，PCNA，Ki67，p-ERK1/2，GAPDH单克隆抗体，稀释度为1∶100)于4℃孵育。第2天加二抗溶液，稀释度为1∶200，室温孵育1 h，滴入化学曝光液，在凝胶成像系统中曝光。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-221在AMI大鼠心肌中的表达 与假手术组miR-211表达量(0.84±0.08)相比，AMI组(3.28±0.30)显著提高(P<0.01)。

2.2miR-221 inhibitor在AMI大鼠心肌中miR-221表达量的作用 与假手术组miR-211表达量(0.88±0.08)相比，AMI组(3.22±0.30)及对照组(3.20±0.30)均显著提高(P<0.01)；与AMI组及对照组相比，抑制组(1.35±0.13)显著降低(P<0.01)。

2.3miR-221对AMI大鼠心脏功能的影响 与假手术组和抑制组比较，AMI组及对照组LVEF、FS水平均显著降低，而LVEDD及LVESD水平均显著升高(P<0.01)。见表1。

2.4miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌AI的作用 与假手术组心肌AI(2.48±0.20)相比，AMI组(36.71±3.64)及对照组(36.29±3.62)均显著提高(P<0.01)；与AMI组及对照组相比，抑制组(7.43±0.69)显著降低(P<0.01)。

2.5miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌组织中Caspase-3及Caspase-9活性影响 与假手术组相比，AMI组及对照组中心肌组织中Caspase-3及Caspase-9活性明显升高(P<0.01)；与AMI组及对照组相比，抑制组中心肌组织中Caspase-3及Caspase-9活性显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 miR-221对AMI大鼠心脏功能的影响及miR-221抑制剂对心肌组织中Caspase-3及Caspase-9的作用

2.6miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表达量的影响 与假手术组比较，AMI组及对照组中Bcl-2、PCNA及Ki67表达量明显下调(P<0.01)，Bax表达量明显上调(P<0.01)；与AMI组及对照组比较，抑制组中Bcl-2、PCNA及Ki67表达量明显上调(P<0.01)，Bax表达量明显下调(P<0.01)。见图1，表2。

表2 miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67表达量的影响

2.7miR-221 inhibitor对AMI大鼠心肌组织中p-ERK1/2表达量的影响 与假手术组p-ERK1/2表达量(1.88±0.16)比较，AMI组(0.85±0.08)及对照组(0.84±0.08)明显下调(P<0.01)；与AMI组及对照组比较，抑制组(1.63±0.15)明显上调(P<0.01)。见图2。

1～4：假手术组、AMI组、对照组、抑制组；下图同图1 miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表达量的影响

图2 miR-221抑制剂对AMI大鼠心肌组织中p-ERK1/2表达量的影响

3 讨 论

近年研究证实miRNA在AMI、心律失常、心力衰竭等心血管疾病中异常表达，包括miR-221〔4,9〕。miR-221与miR-222是同源miRNA，最初是从斑马鱼中克隆并得到证实，后来又在HL-60白血病细胞得到确证。miR-221定位于人类X染色体的p11.3区，在众多肿瘤组织中高表达，因此被认为是一种有癌基因的miRNA〔10〕。Souza等〔6〕对心力衰竭大鼠心肌测量miR-221显示为高表达。研究发现AMI患者miRNA表达异常，以miR-221表达为主，为健康人的3.89倍。同时还证实miR-221有心肌保护作用，能抑制缺血再灌注引起的心肌损伤〔8〕。

AMI过程中会产生大量的活性氧，使得心肌细胞凋亡，心肌损伤，甚至可能引起心力衰竭与心室重构。故控制AMI心肌细胞凋亡，对AMI的发展有遏制作用〔11，12〕。本研究结果表明miR-221 inhibitor可有效抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡。

细胞凋亡受凋亡蛋白调控，例如Bcl-2家族，Caspase家族等。其中Bcl-2是最为多见的抑凋亡蛋白，Bcl-2可与促凋亡蛋白Bax结合，使得凋亡信号传递出现障碍，增加细胞存活和增殖速度。Bax还能自身形成二聚体，将细胞凋亡信号的传递至Caspase家族，帮助信号由Caspase-9传递至Caspase-3，最终诱导细胞发生凋亡。另外PCNA是一种从系统性红斑狼疮中发现的核内多肽，在细胞周期的G1期表达，在S期达到顶峰，是细胞增殖状态评价指标之一。Ki67是从兔常规血清中发现的一种增殖性细胞核标志物，在G1后期出现，在M期达到顶峰，与细胞的有丝分裂密切相关。因此进一步探讨miR-221抑制剂对细胞凋亡调控相关蛋白的影响有助于其机制的发现，本研究结果表明miR-221抑制剂能显著上调Bcl-2，PCNA及Ki67表达，下调Bax表达，同时降低Caspase-3及Caspase-9活性，最终抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡。另外细胞的凋亡、增殖、分化等生物学行为受多种信号通路的调控，ERK就是其中一种。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的关键调控点，在细胞静息条件处于细胞质中，一旦被上游信号激活磷酸化后，能转入细胞核内，调控靶基因的转录，进而参与细胞的生命活动〔13〕。且有研究证实miR-221与MEK/ERK信号通路密切相关〔14〕。本研究结果表明miR-221 inhibitor能通过上调p-ERK1/2表达，继而调控细胞凋亡相关蛋白表达，最终抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡。