羽扇豆醇通过NF-κb信号通路调控胃癌小鼠免疫微环境

姜瑞 陈佳 侯向红

(甘肃省人民医院消化内镜中心，甘肃 兰州 730000)

胃癌发病率位居我国恶性肿瘤的首位〔1〕。研究指出，我国每年新增胃癌病例约68万，占全球每年新增胃癌病例的42%，且死亡率已超过世界平均水平的2倍〔2〕。目前临床上针对胃癌患者常采用手术、放化疗和靶向治疗等，但手术有明显局限性，且各种方案的综合疗效不甚理想〔3,4〕，尚需探讨新的治疗方案。肿瘤微环境是指肿瘤细胞所处的内环境，肿瘤细胞可通过自分泌与旁分泌改变并维持自身生存和进展，全身与局部组织亦可通过调节分泌、代谢、免疫等影响肿瘤生长。有报道指出，核转录因子(NF)-κb包括5种亚基，其中包括NF-κb p65，在致病因素刺激下NF-κb p65活化，与此同时肿瘤组织T细胞活化，可分泌大量的白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，而此类因子均有免疫抑制作用，进而可参与恶性肿瘤细胞免疫逃逸〔5〕。因此调节胃癌免疫微环境是抑制肿瘤生长的可行途径。羽扇豆醇是从羽扇豆种子的表皮、无花果树等提炼的，可抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫。有研究显示，羽扇豆醇可抑制抗原递呈细胞的成熟与活化，下调TNF-α表达，治疗急性移植物抗宿主病〔6〕。另有研究推测羽扇豆醇有抗消化系统恶性肿瘤的作用且很可能是通过调节免疫微环境实现的〔7〕。但羽扇豆醇是否可通过调节NF-κb通路调控胃癌荷瘤小鼠的免疫微环境发挥抗肿瘤效应尚不可知。本研究旨在探讨羽扇豆醇通过NF-κB信号通路调控胃癌小鼠免疫微环境的作用。

1 材料与方法

1.1材料 实验细胞与动物：小鼠胃癌细胞株MFC购自上海雅吉生物科技有限公司；C57BL/6J雄性小鼠50只，清洁级，7～9周龄，18～22 g，购自上海史莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2019-0003。

药品与试剂：羽扇豆醇(上海丹施生物科技有限公司，纯度>98%)；常山酮(成都彼样生物科技有限公司，纯度>98%)；膜联蛋白V(Annexin)V-FITC、碘化丙啶(PI)染料(南京沃博生物科技有限公司，批号：1912101、1911017)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京酷来搏科技有限公司，批号：1910118)；Trizol试剂(上海联迈生物工程有限公司，批号：1910154A)；逆转录试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司，批号：1911014102)；NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α、β-actin(内参)上下游序列(委托大连宝生物科技有限公司合成)；蛋白定量试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司，批号：1911142018)；兔抗鼠NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α单克隆抗体(Abcam中国公司，批号：1911014、1910185、1912148、1912136)；酶标记的山羊抗兔NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α多克隆抗体(Abcam公司，批号：1910102、1911107、1912186、1912192)。实验设备：TDZ5-BP型医用离心机(长沙湘锐离心机有限公司)；530-119型游标卡尺(昆山艾弗特计量仪器有限公司)；JY10001型电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)；BriCyte E6型流式细胞仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；RM2235型切片机(德国徕卡公司)；CX33型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；Mastercycler nexus flat型聚合酶链反应(PCR)仪(Eppendorf中国有限公司)；ZF208型凝胶图像成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2方法 建模与分组干预：取小鼠胃癌细胞株MFC，常规培养至对数生长期，待细胞接近80%进行消化，收集悬液至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清液以0.9%生理盐水重悬，调整细胞密度至1×107个/ml。对小鼠右后肢脱毛，取0.2 ml注射于其右后肢外侧皮下，0.2 ml/只。隔日用游标卡尺测量皮下移植瘤长径与短径，计算肿瘤体积，1 w后肿瘤体积>50 mm3计为建模成功〔8〕。50只小鼠有48只建模成功，建模成功率为96.00%(48/50)。将建模成功小鼠采用随机数字表分为5组，模型组、常山酮组各9只，羽扇豆醇低、中、高剂量组各10只。模型组予以1 ml/100 g体重无菌生理盐水腹腔注射，常山酮组予以2 μg常山酮溶于0.1 ml/100 g体重无菌生理盐水中腹腔注射，羽扇豆醇低、中、高剂量组予以10、20、40 mg/kg羽扇豆醇溶于0.1 ml/100 g体重无菌生理盐水中腹腔注射，1次/d，持续1 w。

肿瘤质量及免疫微环境指标检测：干预后采用断头法处死小鼠，处死前收集尾静脉血，处死后迅速取胸腺、脾脏、癌组织和癌旁组织。采用电子天平称量肿瘤、胸腺、脾脏质量，计算胸腺、脾脏质量指数；采用流式细胞仪检测各组外周血、胸腺、脾脏、癌组织和癌旁组织CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、自然杀伤(NK)细胞占比，所用方法为Annexin V-FITC/PI双染法，并计算CD4+/CD8+。

癌组织病理改变观察：取肿瘤组织冲洗干净后固定，常规脱水、透明处理，石蜡包埋后连续切片(层厚4 μm)，烤片后脱蜡，水化，苏木素染色后伊红复染，脱水、透明、封片，采用光学显微镜观察，其中HE染色需要严格按照试剂盒使用说明书操作。

癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表达检测：采用液氮研磨肿瘤组织并匀浆，提取总mRNA，检测并鉴定，结果为1.8～2.0视为合格，将其逆转录后配制反应体系，其中NF-κb p65上游序列：5′-TGCTAGAGCTATTATAGCT-3′，下游序列：5′-ATGCTTAGAGGCGCGGCTATA-3′；IL-6上游序列：5′-CTGGATATAGGCGCGGCATAT-3′，下游序列：5′-CGGGCTATATAGCGGCTAGCTA-3′；IL-10上游序列：5′-TCGCGTATATGCGTATAGCTAG-3′，下游序列：5′-ATCGCTATAGCTATTAGCGCTAGCT-3′；TNF-α上游序列：5′-CGCGTATATAGGCTATATGGCGCG-3′，下游序列：5′-CTGGAAGTCTTCGAGAGCTAG-3′；β-actin上游序列：5′-AGAGCTCTTCGAGAG-3′，下游序列：5′-TAGAGCTCTCTAGAGCT-3′，预计扩增产物长度分别为：312 bp、320 bp、348 bp、390 bp、280 bp。扩增反应流程：92℃(10 min)，35个循环：95℃(10 s)、60℃(30 s)、95℃(15 s)、75℃(15 s)，最后72℃(5 min)，计算2-△△Ct。

癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α蛋白表达检测：采用Western印迹检测。取肿瘤组织研磨匀浆，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，定量检测。上样、电泳、转膜和封闭，加入一抗，4℃冰箱中孵育过夜；洗脱后加入二抗，室温孵育2 h。洗脱后加入电化学发光液。采用凝胶图像成像分析系统分析蛋白表达。

1.3统计学方法 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组小鼠肿瘤质量比较 常山酮组〔(3.02±0.56)g〕和羽扇豆醇低、中、高剂量组肿瘤质量〔(3.00±0.52)g、(2.71±0.42)g、(2.05±0.37)g〕均显著低于模型组〔(4.85±0.73)g，P<0.05〕，羽扇豆醇中、高剂量组肿瘤质量均显著低于常山酮组、羽扇豆醇低剂量组(P<0.05)，羽扇豆醇高剂量组肿瘤质量显著低于羽扇豆醇中剂量组(P<0.05)。

2.2各组胸腺、脾脏质量指数比较 常山酮组和羽扇豆醇各剂量组胸腺、脾脏质量指数均显著高于模型组(P<0.05)，羽扇豆醇中、高剂量组胸腺、脾脏质量指数均显著高于常山酮组、羽扇豆醇低剂量组(P<0.05)，羽扇豆醇高剂量组胸腺、脾脏质量指数均高于羽扇豆醇中剂量组(P<0.05)，见表1。

表1 各组胸腺、脾脏质量指数比较

2.3各组免疫指标比较 外周血、胸腺、脾脏CD3+CD4+、NK细胞、CD4+/CD8+，癌组织CD4+/CD8+，癌旁组织CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞、CD4+/CD8+比较，常山酮组和羽扇豆醇各剂量组均显著高于模型组(P<0.05)，羽扇豆醇中、高剂量组均显著高于常山酮组、羽扇豆醇低剂量组(P<0.05)，羽扇豆醇高剂量组均高于羽扇豆醇中剂量组(P<0.05)；外周血、胸腺、脾脏Treg，癌组织CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK细胞，癌旁组织Treg比较，常山酮组和羽扇豆醇各剂量组均显著低于模型组(P<0.05)，羽扇豆醇中、高剂量组均显著低于常山酮组、羽扇豆醇低剂量组(P<0.05)，羽扇豆醇高剂量组均显著低于羽扇豆醇中剂量组(P<0.05)，见表2～6。

表2 各组外周血细胞免疫指标比较

表3 各组胸腺细胞免疫指标比较

表4 各组脾脏细胞免疫指标比较

表5 癌组织细胞免疫指标比较

表6 癌旁组织细胞免疫指标比较

2.4各组肿瘤组织病理改变比较 模型组肿瘤细胞排列不规则，异型性明显，间质有充血水肿和炎症浸润，腺体呈囊状扩张；常山酮组和羽扇豆醇低剂量组部分肿瘤细胞排列不规则，有异型性，间质有充血水肿和炎症浸润表现；羽扇豆醇中剂量组少部分肿瘤细胞排列不规则且有异型性，间充质有轻微充血水肿和炎症浸润表现；羽扇豆醇高剂量组肿瘤细胞基本排列规则，细胞异型性不明显，间充质无充血水肿和炎症浸润表现。见图1。

图1 各组肿瘤组织病理改变(HE，×100)

2.5各组癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表达比较 癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表达比较，常山酮组和羽扇豆醇各剂量组均显著低于模型组(P<0.05)，羽扇豆醇中、高剂量组均显著低于常山酮组、羽扇豆醇低剂量组(P<0.05)，羽扇豆醇高剂量组均显著低于羽扇豆醇中剂量组(P<0.05)，见表7，图2。

表7 各组癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA及蛋白表达比较

1～5:模型组,常山酮组,羽扁豆醇低剂量组,羽扁豆醇中剂量组,羽扁豆醇高剂量组图2 各组癌组织NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α蛋白表达

3 讨 论

胃癌的发生与致病微生物感染、饮食中致癌物超标、遗传因素等均相关，可通过直接浸润、血行转移、淋巴转移和腹膜种植等途径扩散〔9,10〕。有研究指出〔11〕，胃癌细胞可通过多种途径逃避机体免疫系统的识别与攻击，称为免疫逃逸，常见的机制有肿瘤细胞抗原缺失及抗原改变、肿瘤细胞共刺激信号异常、肿瘤细胞表达或分泌免疫抑制因子、诱导T细胞凋亡或抑制其活化、抑制机体免疫应答等。另有研究显示〔12〕，肿瘤免疫微环境与病情发展和预后均相关，改善肿瘤免疫微环境有助于增强抗肿瘤效果，改善预后。常山酮是从常山中获取的喹唑酮类物质，有报道〔13〕显示常山酮可调节小鼠的免疫微环境，且该药物在临床抗肿瘤治疗中也显示出良好的应用价值〔14〕，故而本研究选用常山酮作为阳性对照药物。本研究结果提示常山酮和羽扇豆醇均促进胃癌小鼠机体细胞免疫，增强机体对胃癌细胞的识别和免疫杀伤效应，且羽扇豆醇的作用呈剂量依赖性；本研究结果常山酮和羽扇豆醇均可促使CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK细胞进入癌组织发挥抗肿瘤作用，而在发挥此作用的同时上述细胞可被大量消耗，因此癌组织中CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK细胞水平显著下降。T细胞是抗肿瘤免疫中的主力军，有免疫记忆功能和特异性，而NK细胞和Treg细胞也有重要的抗肿瘤作用，分别负责非特异性抗肿瘤和机体内负向调节免疫应答、维持机体免疫平衡〔15〕。有研究显示〔16，17〕，T细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+可通过多种途径抑制肿瘤生长，其中前者水平升高可活化的T细胞分泌大量的IL-6、IL-10和TNF-α等，既可直接破坏肿瘤细胞的结构，还可增强效应细胞的抗肿瘤作用；后者则是主要的细胞毒效应细胞，当CD4+/CD8+升高意味着机体免疫应答及抗肿瘤活性增强，可避免肿瘤细胞免疫逃逸。相关报道〔18〕发现对肝癌荷瘤小鼠予以药物治疗调控免疫微环境可增加抑瘤率，且本研究与该报道中的外周血、脾脏、肿瘤组织及癌旁组织T细胞免疫指标变化趋势相符。本研究结果表明常山酮和羽扇豆醇均可通过调节免疫微环境发挥抗胃癌作用，且羽扇豆醇的作用呈剂量依赖性。T细胞活化可分泌大量的细胞因子，进而通过各种途径发挥抗肿瘤效应。本研究结果表明常山酮和羽扇豆醇均可抑制癌组织中NF-κb p65、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA和蛋白表达。NF-κb p65是一种可与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κb序列特异性结合的和蛋白因子，可由TNF-α受体家族成员激活〔19〕。结合国内外相关报道〔20～22〕，NF-κb p65可通过多种途径参与胃癌的发生和发展，包括激活炎症反应、抑制免疫应答、参与血管生成、细胞黏附、细胞自噬、能量代谢等，可诱导细胞增殖，延长细胞存活期。另有报道指出〔23〕，NF-κb p65激活可促进T细胞活化，增强IL-6、IL-10和TNF-α的表达。但是本研究常山酮组和羽扇豆醇各剂量组癌组织中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA和蛋白降低，可能是由于CD3+CD4+、Treg、NK细胞等进入癌组织后大量被消耗以发挥抗肿瘤作用，因此肿瘤生长被抑制，与此同时IL-6、IL-10、TNF-α的活性下降。羽扇豆醇是一种三萜烯，已被证实有抗氧化、抗炎、抗恶性肿瘤细胞增殖和迁移等作用，且该药物可调节荷瘤实验动物的免疫系统〔24〕，增强免疫应答，抑制恶性肿瘤细胞免疫逃逸。

综上，常山酮和羽扇豆醇均可抑制胃癌小鼠肿瘤生长，还可调节整体细胞免疫和局部细胞免疫指标水平，增强免疫应答，抑制肿瘤免疫逃逸，推测是通过抑制NF-κb p65表达，并通过该通路下调IL-6、IL-10、TNF-α的表达实现此作用的。本研究为胃癌免疫调节治疗研究提供了新方向，但羽扇豆醇是否可通过其他信号通路途径调节胃癌免疫微环境尚不清楚，后期仍需深入研究和探讨，以充分挖掘羽扇豆醇的医用价值。