金雀异黄素对大鼠雪旺细胞生长与凋亡影响的体外研究

段晓英 杜珍武 丁宏 杨忠影 曹振强

(吉林大学第二医院，吉林 长春 130022)

金雀异黄素(Gen)又称金雀异黄酮、染料木黄素、染料木黄酮、4′，5，7-三羟基异黄酮，是一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮类化合物。Gen是强力酪氨酸蛋白激酶的抑制剂和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂。它具有广泛的抗肿瘤药理活性，能通过多种途径抑制肿瘤的生长和转移，诱导肿瘤细胞凋亡〔1～4〕。同时，Gen也是一种理想的抗氧化剂，它可以清除活性氧自由基，降低脂质过氧化产物，诱导提高抗氧化酶活性水平。研究表明，Gen的抗氧化机制可以抑制大脑神经元细胞的氧化应激损伤，从而起到保护中枢神经的作用〔5～8〕。雪旺细胞(SCs)是周围神经系统中特有的胶质细胞，是髓鞘形成的功能细胞，在维持神经结构及神经损伤修复过程中起着重要作用。如何保护SCs是周围神经损伤修复过程中的关键。对Gen的周围神经保护作用〔9〕报道较少，因此本研究拟在体外细胞模型探讨Gen对SCs生长的影响及其相关机制，为Gen在周围神经细胞保护中应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1大鼠SCs培养 RSC96大鼠SCs购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将RSC96细胞培养于含有10%胎牛血清及1%青链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃，5%二氧化碳培养箱内培养。

1.2细胞活性测定 Gen溶于二甲基亚砜(DMSO)。将RSC96的细胞以2 000/孔细胞数接种于96孔细胞培养板，培养基内加入不同浓度的Gen，其浓度分别为4.625 μmol/L，9.250 μmol/L，18.500 μmol/L，37.000 μmol/L，74.000 μmol/L，148.000 μmol/L。同时设对照组(不加药)及DMSO组。培养24 h后，每孔加入CCK-8(北京天恩泽) 10 μl，作用1 h后，应用酶标仪在450 nm处进行OD值检测。之后，每隔24 h检测1次，共检测5次。同时应用倒置显微镜(德国徕卡)进行细胞生长的形态学观察。

1.3细胞周期检测 以1×105/瓶细胞数将RSC96细胞接种于25 cm2细胞培养瓶，分为Gen 74.000 μmol/L组、对照组、DMSO组，每组3瓶。培养24 h后，胰酶消化细胞，吸取细胞消化液，1 200 r/min离心5 min，沉淀细胞。加入1 ml冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定。12 h后1 200 r/min离心5 min，沉淀细胞，弃上清，加入1 ml预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，重悬细胞，离心沉淀细胞，吸除上清。加入碘化丙啶染色液(碧云天试剂)，37℃避光温浴30 min。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

1.4细胞凋亡的荧光染色检测 RSC96细胞以1×104/孔细胞数接种于24孔细胞培养板，加入浓度为37.000 μmol/L及74.000 μmol/L的Gen，同时设对照组(不加药)。药物作用24 h后，应用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术，C1062S)进行细胞凋亡检测。具体方法：吸除细胞培养液，加入PBS洗涤1次，加入195 μl Annexin V-FITC结合液。加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育20 min，随后置于冰浴中。在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光。随机拍照5个视野，分别计数染色细胞及总细胞数，计算染色细胞的百分比。

1.5基因表达检测 RSC96细胞以1×106/孔细胞数接种于6孔细胞培养板，分别加入74.000 μmol/L Gen与4 μl DMSO，药物作用24 h后，收集细胞，加入Trizol(Invitrogen)裂解细胞，通过氯仿抽提、异丙醇沉淀及70%乙醇纯化获取细胞总RNA，获得RNA通过凝胶电泳观察完整性，通过紫外测定260 nm与280 nm OD值评价提取RNA质量与纯度。 取1 μg提取的总RNA，应用cDNA合成试剂盒(大连宝生物)进行逆转录，合成第一链cDNA。以cDNA为模板，实时定量PCR检测大鼠B细胞淋巴瘤/白血病(BCL)2、胱天蛋白酶(CASP)3、肿瘤蛋白P53(TP53)、细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CDKN)1B、CDKN1A的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因。各基因表达检测引物：BCL2：上游：CCGGGAGAACAGGGTATGATAA，下游：CCCACTCGTAGCCCCTCTG；CASP3：上游：GGAGCTTGGAACGCGAAGAA，下游：ACACAAGCCCATTTCAGGGT；TP53：上游：TACTTCCCAGCAGGGTGTCA，下游：ACACTTGGAGGGCTTCCTCT；CDKN1A：上游：GGGATGCATCTATCTTGTGATATGT，下游：CGAACAGACGACGGCATACT；CDKN1B：上游：TCGACGCCAGACGTAAACAG，下游：CGCAATGCTACATCCAATGCT，内参基因GAPDH：上游：TAGACAAGATGGTGAAGGTCGG，下游：CTTGACTGTGCCGTTGAACTTG。

2 结 果

2.1Gen对RSC96细胞周期的影响 Gen 37.000 μmol/L组RSC96细胞处在G2/M期细胞比例明显多于对照组(P<0.05)，而G1期细胞比例明显减少，明显少于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞周期比较

2.2Gen对大鼠RSC96细胞生长的影响 Gen 37.000 μmol/L组RSC96细胞活性在72 h及96 h明显低于对照组(P<0.05)。Gen 74.000 μmol/L组及148.000 μmol/L组，从24 h开始直到120 h细胞活性均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表2。细胞形态学观察结果显示Gen 37.000 μmol/L组、74.000 μmol/L及148.000 μmol/L组72 h细胞数目较对照组明显减少。见图1。

表2 各组培养不同时间细胞活性比较

图1 Gen作用大鼠RSC96细胞72 h倒置显微镜形态学(×100)

2.3Gen诱导大鼠RSC96细胞凋亡 与对照组〔(1.561±0.381)%〕相比，Gen 37.000 μmol/L组凋亡细胞数〔(2.827±0.641)%〕有所增多，但差异无统计学意义(P>0.05);Gen 74.000 μmol/L组凋亡细胞数〔(34.458±4.351)%〕显著增多,明显高于对照组和Gen 37.000 μmol/L组(均P<0.01)。见图2。

图2 Gen作用大鼠RSC96细胞24 h后细胞凋亡(×100)

2.4Gen对RSC96细胞生长相关基因表达影响 与DMSO组相比，Gen 74.000 μmol/L组作用24 h后，CDKN1A基因表达明显升高，其余基因表达无变化。见表3。

表3 各组CASP3、BCL2、CDKN1B、CDKN1A及TP53 mRNA表达比较

3 讨 论

在我国，中老年糖尿病的发病率逐年升高。糖尿病周围神经病变(DPN)是最常见、最复杂的并发症之一，其中70%～80%的中老年糖尿病患者都会出现感觉和运动神经损伤，严重影响了患者的生活质量，甚至影响生存。SCs是周围神经修复过程中最关键的构建细胞，它对于髓鞘的生成、营养神经元和支持神经结构都起着至关重要的作用。已有研究表明，Gen可以改善糖尿病小鼠神经生长因子含量和血管功能障碍〔10〕，还可以逆转周围神经损伤后的疼痛过敏反应，可能与Gen发挥其抗氧化性有关〔11〕。本研究说明37.000 μmol/L Gen减缓RSC96细胞生长；细胞周期抑制蛋白可能在抑制RSC96细胞生长方面发挥作用。研究报道Gen作为酪氨酸激酶抑制剂，对SCs增殖分化，髓鞘形成产生影响〔12,13〕，可见Gen对RSC96细胞的抑制作用通过多种途径完成，并存在剂量依赖性。同时，本课题组还要进一步实验验证Gen能否对病理条件下氧化损伤的RSC96细胞有影响及其作用的相关浓度分析。总之，本研究在体外细胞水平阐明Gen能够抑制大鼠SCs增殖，初步分析了其机制，对Gen的治疗选择及剂量应用具有一定借鉴意义。