GFI1B在急性髓系白血病中表达及对临床疗效的评估

张志敏，刘鑫艳，张永梅，潘志兰，周 洁，林凤茹

独立生长因子1B(growth factor-independent 1B， GFI1B)是一种核转录抑制因子，位于人类基因组9q34.13[1]。GFI1B基因主要表达于胎儿、成人的红系和巨核系，是两系生成和分化过程中一种必需的转录因子，故其表达水平的高低与急性白血病、T细胞淋巴瘤、重型再生障碍性贫血等血液系统疾病密切相关[2]。急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，以骨髓和外周血中原始和幼稚髓细胞异常增生为特征[3]。目前有关GFI1B基因在AML中的表达规律及其与患者临床特征之间的关系报道较少[4]，本研究通过分析AML患者GFI1B表达及与其病情、预后的关系，以期研究GFI1B的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 回顾性分析2018年5月—2020年3月本院收治的AML患者的临床资料。纳入标准：均由临床、血常规、骨髓象确诊为AML[5]；病例资料完整；年龄<80岁。排除标准：合并其他血液系统疾病者；合并心、肝、肾等器官和系统严重疾病或恶性肿瘤者；妊娠期和哺乳期女性、精神障碍者。根据纳入排除标准最终纳入106例AML为观察组，男61例，女45例；年龄26～78(43.52±5.73)岁；AML类型：M1型28例、M2型22例、M5型21例、M4型20例、M6型10例，M7型5例；另选取同期在本院进行体检的健康者100例为对照组，男性51例，女性49例；年龄27～77(43.54±5.78)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1检测仪器及试剂：以实时荧光定量PCR仪(PQ-PCR)及超敏CRP检测仪(PQ-CRP)检测GFI1B mRNA的表达并进行动态观察，荧光分析仪(ABI-5700)购自美国PE公司，PQ-PCR引物合成、荧光探针合成、PQ-PCR用dNTP、5×PQ-PCRbuffer购自广东达安临床检验中心，PCR引物合成购自北京赛百盛公司。

1.2.2检测方法：①细胞分离、总RNA提取：抽取2组新鲜外周血4 ml，肝素(107 U/L)抗凝，加Ficoll淋巴细胞分离液4 ml，离心(2000 r/min)20 min分离出单个核细胞，0.9%氯化钠注射液洗涤3次。采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，1 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪显示28 S和18 S两条清晰的条带，显示提取完整的RNA。②cDNA的合成：逆转录体系20 μl，包括细胞总RNA 1 μg，随机引物500 ng，RNA酶抑制剂25 U，5×逆转录反应缓冲液4 μl，MMLV逆转录酶200 U。37℃、60 min，94℃、5 min，1℃、2 min终止反应。③GFI1B正向引物：5'-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3'，GFI1B反向引物：5'-CCGGCTCTCGTTTGAGGTT-3'，GFI1B探针序列：5'-FAM-CCGGTGCCCAGAGACCAGGC-TAMRA-3'GFI1B扩增片段长度为117 bp。④RQ-PCR反应：待测样本和阳性标准品按以下反应体系进行：反应体系50 μl，包括5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F(10 pmol/μl)1 μl，下游引物R(10 pmol/μl)1 μl，探针(5 pmol/μl)1 μl，dNTPs(10 mmol/L)1 μl，Taq酶(3 U/μl)1μl，cDNA或阳性标准品1 μl，ddH2O34 μl。扩增条件为：93℃、3 min，然后93℃、30 s，55℃、45 s，共40循环。⑤产物的定量分析：反应结束后，任选4～5个阳性模板标准梯度点分析，若相关系数r2>0.97，表明线性关系良好，可确定为定量标准曲线，根据标准曲线得出样本荧光定量反应的绝对定量值，即为目的基因的表达水平。

1.2.3疗效判断：参考《血液病诊断及疗效标准》(第4版)评估。①完全缓解(CR)：临床无白血病细胞浸润的症状和体征；血红蛋白≥100 g/L(男性)或≥90 g/L(女性)，中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血无白血病细胞；骨髓中原始细胞≤5%。②部分缓解(PR)：骨髓中原始细胞5%～20%，或临床、血常规中有一项未达到CR标准。③未缓解(NR)：骨髓象、血常规及临床表现未达上述标准。

1.2.4复发难治白血病诊断标准[6]：①复发性AML定义为CR后外周血再次出现白血病细胞或骨髓中原始细胞>5%(除巩固化疗后骨髓再生等其他原因外)或出现白血病髓外浸润。②难治性AML:经过标准诱导治疗2个疗程后未达到CR的初诊患者；CR后经过巩固强化治疗6个月内复发者；6个月后复发但经常规化疗无效者；2次或多次复发者；髓外白血病持续存在者。

1.3随访方法 观察组进行为期6个月的随访，随访方式包括电话随访、门诊复查[7]；随访截止时间为2020年9月，了解预后情况。

2 结果

2.1GFI1B表达水平比较 2组GFI1B表达水平分别为观察组(0.76±0.12)×106拷贝/μl cDNA、对照组(0.06±0.01)×106拷贝/μl cDNA。观察组GFI1B表达水平高于对照组(P<0.01)。

2.2CR、PR及难治复发的AML患者GFI1B表达比较 经化疗后，CR 30例，PR 49例，难治复发27例。CR AML患者治疗前后GFI1B的表达水平分别为(0.75±0.14)×106拷贝/μl cDNA、(0.13±0.02)×106拷贝/μl cDNA，PR AML患者治疗前后GFI1B的表达水平分别为(0.78±0.11)×106拷贝/μl cDNA、(0.42±0.09)×106拷贝/μl cDNA，难治复发AML患者治疗前后GFI1B表达水平分别为(0.74±0.16)×106拷贝/μl cDNA、(0.78±0.15)×106拷贝/μl cDNA。与治疗前比较，CR和PR AML患者治疗后GFI1B表达水平显著降低，且CR患者低于PR和难治AML复发者，PR AML患者低于难治复发AML患者(P<0.05，P<0.01)。难治复发AML患者治疗前后GFI1B表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3观察组预后情况 截至随访结束，观察组106例中生存61例、死亡45例，生存率57.55%，病死率为42.45%。

2.4单因素分析 年龄、性别与AML患者预后生存无关(P>0.05)，白细胞水平、髓外浸润、危险度分型、达CR所需疗程数、查尔森合并症指数(CCI)评分及GFI1B表达水平为AML患者预后生存的危险因素(P<0.05)。见表1。

表1 影响AML预后生存的单因素分析[例(%)]

2.5多因素分析 经非条件多因素Logistic回归模型分析得，有髓外浸润、CCI评分≥2分及GFI1B表达≥0.5×106拷贝/μl cDNA是影响AML患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响AML预后生存多因素Logistic回归分析

3 讨论

AML初始的标准诱导化疗方案可使缓解率达50%以上[7]。但仍有部分患者终将复发，一旦复发病死率显著增加。年龄、髓外浸润、CCI评分、白细胞水平、免疫分型等均对AML预后存在一定影响[8]。本研究结果显示，髓外浸润、CCI评分是影响预后生存的独立危险因素，与既往研究一致[9]。国内外学者发现了一批与肿瘤发生、发展和预后相关的基因，针对癌基因的分子靶向治疗也取得重要进展[10]。AML是造血干细胞的异常增殖和成熟障碍所致，且是一个多步骤多基因参与的过程，因此该病发生的第一步往往是由于控制细胞生长的基因表达异常或其编码蛋白功能异常[11]。调控细胞转化最常见的一类基因是以转录因子形式起作用，最终导致细胞转录调控异常，GF正是这类基因[12]。1993年，Gilks等在大鼠T细胞淋巴瘤的MOMULV的整合位点上第一次发现了GFl1基因[13]。GFI1B是GFI1家族的成员之一，研究发现，GFI1B可加速T细胞淋巴瘤的发展；同时由于GFI1B也表达于造血干细胞，其对维持造血干细胞的自我更新活性及功能完整性尤为重要[14]。此外，近年基因打靶实验揭示了GFI1B在中性粒细胞分化中也发挥着重要作用。

动物研究显示，GFI1B缺乏的小鼠不能生成成熟的红细胞，而在这些小鼠的肝脏中红系和巨核系生成的前体物质增多，这表明GFI1B在红系和巨核系的生成和分化中起了重要的作用，并且GFI1B在造血干细胞中表达，以不依赖与红细胞生成素的方式诱导红系的生成[1,15-16]。2006年Ahmet等首次报道了GFI1B在急性白血病中呈现高水平表达，尤其是在AML患者中表达显著增高[17-18]。本研究结果显示，观察组GFI1B表达水平高于对照组，同时在疗效满意AML患者中GFI1B水平呈下降趋势，这与既往结果一致。有力地佐证了GFI1B可参与AML的发生，并可为临床疗效评估提供了有效依据。有研究认为GFI1B基因不仅能够诱导细胞周期依赖激酶抑制物p2l Wafl/Cip的产生和表达，使细胞滞留在G0期，还能与GFl1基因相互作用使细胞癌变，故GFI1B基因表达水平高的AML病死率较高[19-20]。本研究结果显示，GFI1B表达是影响AML预后生存的独立危险因素，这提示进行GFI1B基因的监测对AML预后有着重要的指导意义。

综上所述，GFI1B在AML患者中呈高表达状态，其表达异常升高者预后死亡风险更高，临床可加强对AML患者GFI1B的动态监测，以提高生存率。本研究不足之处在于纳入病例数较少，未来需扩大病例数进一步验证。