高压电场低温等离子体对红枣干果的冷杀菌工艺优化及其对品质的影响

魏巧云，袁 园，高 婷，章建浩，严文静

（南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏省肉类加工与质量控制协同中心，江苏南京 210095）

干制红枣因酸甜可口、风味独特，深受消费者喜爱[1]。然而干制红枣贮藏期间易受微生物污染出现发霉、蛀虫等问题，严重影响其商业价值和食用安全性[2]。目前用于干制红枣的杀菌、防霉保质的方法有过热蒸汽[3]、一氧化氮熏蒸[4]、涂膜[5]和硫磺熏蒸等。但这些杀菌保质方法或处理时间较长或对品质有一定的影响[3]。因此，开发一种高效、快捷、绿色的杀菌技术是抑制干制红枣贮藏期微生物滋生引发病害和保证品质的关键。

高压电场低温等离子体技术（High Voltage Electric Field Cold Plasma，HVEF-CP）是一种国际新型食用冷杀菌技术，通过高压放电电离空气产生活性物质作用于食品表面的微生物达到杀菌的目的[6]。除了细菌外，等离子体技术已被证实对真菌孢子[7−8]和病毒[9]也有较好的杀灭效果。等离子体杀菌技术在处理样品过程中不会使食品产生明显的增温，因此不会破坏红枣的品质，且在包装后进行杀菌，能够有效的减少食品被二次污染的可能[10]，具有高效、快捷、安全无污染等特点。目前该技术已经广泛用于各类生鲜肉制品[11−13]、生鲜果蔬[14−15]等产品的杀菌保鲜，而对干制品的杀菌研究主要集中在小麦[16]和花生[17]等，等离子体技术应用于红枣干果的杀菌研究尚未见报道。

常见的等离子体放电类型有电晕放电、沿面放电、介质阻挡放电（Dielectric barrier discharge plasma，DBD plasma）等，介质阻挡放电又分为常压放电和高压放电，本文实验所用设备为高压放电介质阻挡等离子体。目前报道的介质阻挡等离子体设备可控变量主要是处理电压和时间，国内外对于工作频率因素的相关研究较少。Sen等[18]研究发现，等离子体在25 kHz高频率、655 W功率时，等离子体技术可以分别使曲霉菌属和黄曲霉降低5.5 lg CFU/g和5.4 lg CFU/g。Lukic等[19]以频率为参考因素，发现当等离子体设备频率改变后对葡萄酒的颜色无显著影响，但对酚类物质有不利影响。本研究拟引入DBD频率为实验变量因素，主要研究了处理电压、频率和时间及其交互作用对红枣杀菌效果的影响，通过响应曲面优化了红枣最佳杀菌工艺条件，明确了等离子体处理对红枣干果贮藏期微生物的影响，为等离子体冷杀菌技术应用于即食干果的冷杀菌领域提供初步的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣干果 散装红枣干果，新疆巴音郭楞（农户自产自销），挑选外观规整，颜色均一，大小均匀、无损伤枣果进行试验）；平板计数培养基（PCA）、氯化钠、氢氧化钠、孟加拉红培养基、霉菌酵母计数培养基（PDB） 青岛海博生物技术有限公司；红菲啰啉 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化铁、抗坏血酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验所用水 实验室自制超纯水。

CPS-1型低温等离子体发生器 可控制电压、频率等参数，可控显示屏电压0～80 kV、可控频率范围50～200 Hz，南京屹润等离子科技有限公司；CTHI-250B恒温恒湿箱 上海施都凯设备公司；MAPH360型复合气调包装机（配有气体比例检测装置）苏州森瑞保鲜设备有限公司；SMIC型电热灭菌锅

上海申安医用仪器厂；CR-400型全自动测色色差仪柯尼卡美能达控股公司；AUY120型电子天平日本岛津公司；PAL-BXIACID5型数显糖度计 上海叶拓科技有限公司；实验室超纯水系统 南京总馨纯水设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DBD杀菌方法 样品干红枣地下室常温放置4 d（测得红枣干果表面中所带微生物较为一致，约3.15 lg CFU/g）。称取（80±2）g的红枣为一个样，平铺于PP包装盒（17 cm×12 cm×3.6 cm）内并充空气密封，然后置于DBD设备的两个极板中间，调节两板之间的距离为包装盒高度（约3.7 cm），使两电极板紧紧卡住包装盒，从而充分电离包装盒内的空气；之后进行高压电场低温等离子体冷杀菌处理，其中每三个样为一个处理组，分别在不同处理条件下处理，待处理结束后，室温放置约2 h，进行微生物检测，每组重复三次。

1.2.2 DBD杀菌条件优化方法

在我国将来的药品专利链接制度实践中，可以预见也同样会出现“反向支付和解”的可能，对此需要提前在制度设计中加以规制。一方面，可以通过专利挑战和仿制药市场独占期等具体规制的设计，降低当事人通过达成“反向支付和解”协议的获利空间；另一方面，可以借鉴美国经验，通过反垄断制度来对相关协议审查并对涉嫌垄断的行为予以规制。

1.2.2.1 单因素实验设计 固定处理频率90 Hz，单次处理时间120 s，考察不同处理电压50、57、64、71、78 k V下杀菌率与菌落总数；固定处理电压64 kV，处理频率90 Hz，考察不同单次处理时间30、60、90、120、150、180 s（每个样品在DBD设备下循环处理三次，间隔30 s）下杀菌率与菌落总数；固定处理电压64 k V，单次处理时间120 s，考察不同处理频率50、70、90、110、130 Hz下的杀菌率与菌落总数。

1.2.2.2 响应曲面优化设计 根据单因素实验情况，设计三因素三水平的响应曲面试验设计。如表1所示，利用BOX-Behnken Design（BBD）试验设计拟合出多项式回归模型并进行方差分析。

表1 响应曲面设计因素水平表Table 1 Factor level in response surface design

1.2.3 紫外辐照杀菌方法 干红枣样品室温平铺在超净台内，打开紫外灯进行杀菌，辐射距离为50 cm，辐射时间为30 min。杀菌结束后迅速将红枣干果烘干装入无菌自封袋中，并封口，进行微生物检测，重复三次。

1.2.4 DBD处理对红枣干果贮藏期微生物数量的影响 以优化后条件处理的红枣干果为处理组，同样条件下未经DBD处理组为对照组，放置在恒温恒湿箱（温度为（25±5）℃、贮藏湿度为75%RH±5%RH）条件下进行破坏性贮藏实验，每15 d取一次样，对菌落总数、霉菌与酵母总数、大肠菌群进行测定。

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 微生物的检测 参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》测菌落总数[20]；参照GB 4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》测霉菌与酵母总数[21]；参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测大肠菌群数量[22]。

1.2.5.2 品质理化指标的测定 水分参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》直接干燥法；VC含量参考李园园等[23]的方法，采用邻菲啰啉比色法测量；可溶性固形物（total soluble solids，TSS）参照陈燕等[4]的研究方法，数显糖度计测定可溶性固形物TSS的量；可滴定酸（titrate acid，TA）测定参考江英等[24]的方法，采用NaOH滴定法，以苹果酸百分数表示；颜色的测定，采用自动色差仪对红枣的亮度值（L*）、红色值（a*）进行测定[25]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 DBD处理条件的确定

2.1.1 DBD处理电压的确定 由图1A可知，随着电压的升高，杀菌率随之增高，当电压高于71 kV时，杀菌率趋于平缓。统计分析表明，处理电压50～71 kV之间的杀菌率有显著差异（P<0.05）。DBD处理电压为50 kV时，红枣表面菌落总数由原始菌落3.15 lg CFU/g下降为2.87 lg CFU/g，杀菌率仅为80%，推测可能低电压难以激发起杀菌作用的活性物质或产生活性物质的量少，不足以杀死全部微生物[26]，当处理电压为64 k V时，杀菌率为96.3%，红枣干果表面菌落总数为1.74 lg CFU/g，当电压上升为71 k V时，红枣表面菌落总数由3.15 lg CFU/g下降为1.43 lg CFU/g，此时杀菌率高达98.1%。当电压为78 k V时，DBD可使红枣表面菌落数减少1.77 lg CFU/g，此时杀菌率为98.3%，与71 k V条件下的杀菌率无显著差别，推测由于在高电压（>71 kV）条件处理下，DBD设备放电剧烈，导致包装盒有轻微的穿孔，致使产生的等离子体有部分外漏，故综合考虑选择实验中点为64 k V，处理电压的选择范围为57～71 kV。

图1 等离子体不同单因素条件对红枣表面杀菌率的影响Fig.1 Effect of different single factor on thesterilization efficiency of dried jujube fruit

2.1.2 DBD处理时间的确定 由图1B可知，DBD对红枣干果的杀菌率随着处理时间的延长整体呈现递增趋势。DBD对红枣干果的杀菌率随着处理时间的延长而显著提高（P<0.05）。当单次处理时间为30 s时，菌落总数由原先的3.15 lg CFU/g下降为2.56 lg CFU/g，杀菌率为75.2%。处理时间增至120 s时，红枣表面菌落总数下降至1.48 lg CFU/g，此时杀菌率达98.0%，说明随着处理时间的增加，等离子体技术对食物表面的杀菌效果越好，与Choi等[27]试验结果较为一致，当处理时间高于120 s后，杀菌率趋于平缓。当处理时间为150 s时，此时表面的菌落总数为1.11 lg CFU/g，杀菌率为99.1%，杀菌结果与单次处理时间120 s时的数据无显著性差异。综上，以单次处理时间120 s为中点，响应面试验选取单次处理时间的最佳范围为90～150 s。

2.1.3 DBD处理频率的确定 由图1C可知，随着处理频率的增加，红枣干果的杀菌率先增长再趋于平缓后缓慢下降。当处理频率小于90 Hz时，杀菌率随着处理频率的升高显著提高（P<0.05），当频率高于90 Hz时，杀菌率随着处理频率的升高趋于平缓并有所下降。当处理频率为50 Hz时，红枣干果的菌落数由3.15 lg CFU/g下降为1.98 lg CFU/g。由50 Hz上升到90 Hz时，红枣表面的菌落总数由1.98 lg CFU/g降低为1.54 lg CFU/g，杀菌率由93.4%上升为97.6%。当处理频率上升为130 Hz时，杀菌率可达96.8%，此时杀菌效果显著高于处理频率为50 Hz时的杀菌率。杀菌频率条件为90 Hz时杀菌效果最佳，综上，频率选择范围为70～110 Hz。

2.2 优化试验结果与参数分析

2.2.1 响应曲面优化试验设计与结果 实验由软件Design-export中Box-Behnken Design（BBD）设计完成，设计三因素三水平，共15组随机实验[28]。实验设计表及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

2.2.2 回归方程的建立及显著性分析 利用Design Expert软件对实验进行多元回归分析，得到响应值与各因素之间的二次回归拟合方程。如下：

此模型的方差分析如表3所示。

由表3可知，模型极显著（P<0.0001），说明本文构建的二次回归模型具有统计学意义。而模型的失拟项不显著（P=0.4028>0.05），说明该模型与实际实验结果拟合度较好。模型的决定系数R2=0.9916，校正系数R2adj=0.9809，说明该模型可以很好解释试验结果。从模型中可以看到各个因素及之间的交互作用对红枣干果杀菌率的影响，其中一次项X1、X2，交互项X1X2，X1X3和二次项X12、X32对应的响应值的影响是极显著的（P<0.01）；说明该模型不是简单的线性模型[29]。F值反映各因素之间对响应值的贡献程度，F值越大，说明该因素的影响越大。根据表3的F值大小，得到的各因素影响值排序为：电压>时间>频率。

表3 模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of the mode

2.2.3 响应曲面各因素交互作用结果分析 利用Design Expert V 8.0.6软件对各因素及其交互作用对响应值的影响进行分析，所得的红枣杀菌率与各因素的响应面3D图如下。以下三个3D响应面图分别反映了三个因素X1、X2、X3的交互作用对响应值杀菌率的影响。

2.2.3.1 工作电压与处理时间之间的交互作用 图2为固定处理频率为90 Hz时，处理电压和处理时间的杀菌率响应曲面图，可以看出处理时间和电压交互作用对响应值的影响极显著（P<0.01），图中两因素的等高线趋于椭圆形，曲面坡度较为陡峭，表明处理电压与处理时间交互作用显著[30]。当处理电压一定时，红枣的杀菌率随着处理时间的增大而增大。当处理时间一定时，红枣杀菌率随着处理电压的增大而呈现先快速增大后趋于平缓的趋势，由图2可知当处理电压为64～71 kV，处理时间高于120 s时，杀菌率趋于最大值。响应曲面的形状反映了各因素对变量的交互作用。等高线曲率越大，表明交互作用对响应值的影响越显著，处理电压比处理时间的曲率大，说明电压对等离子体杀菌率更显著。

图2 处理时间和处理电压交互作用对红枣干果杀菌率的响应面图Fig.2 Responsesurface of the effectsbetween treatment time and treatment voltage on sterilization efficiency of dried jujube

2.2.3.2 工作电压与处理频率之间的交互作用 由图3为固定处理时间为120 s时，处理电压和处理频率对杀菌率影响的响应曲面图。由图可知处理电压和处理频率的交互作用对红枣杀菌率的影响极显著（P<0.01）。处理频率与处理电压两因素相互作用的等高线图呈椭圆，3D曲面图坡度陡峭，表明两因素交互作用强，对响应值影响较大。沿着处理电压方向，等高线密度明显高于处理频率方向，说明处理电压对红枣杀菌率的影响大于处理频率。当处理频率一定时，杀菌率随着处理电压的增大先增大后缓慢下降，当处理电压一定时，杀菌率随着频率的升高呈现先升高后降低的趋势，处理电压在60～67 k V，处理频率在80～100 Hz间，杀菌率达到最大值。

图3 处理频率和处理电压交互作用对红枣干果杀菌率的响应面图Fig.3 Response surface for the effects of processing frequency and processing voltage on sterilization efficiency of dried jujube

2.2.3.3 工作电压与处理频率之间的交互作用 图4为固定处理电压为64 kV时，处理时间与处理频率对杀菌率影响的响应曲面图，两因素的等高线图趋于圆形，3D曲面图较为平滑，两因素之间的交互作用对响应值较强，方差分析结果表示两因素间交互作用不显著（P>0.05），对杀菌率的影响较小。处理时间方向等高线密度高于处理频率，表明说明处理时间对红枣杀菌率的影响大于处理频率。由图4可知，当处理时间一定时，杀菌率随着处理频率的升高先缓慢上升，后缓慢下降；当处理频率一定时，杀菌率随着处理时间的提高而提高。

图4 处理频率和处理时间交互作用对红枣干果杀菌率的响应面图Fig.4 Response surface for the effects of processing frequency and processing timeon sterilization efficiency of dried jujube

2.2.4 最佳工艺条件的确定及验证实验 通过软件分析可得最佳杀菌条件为：处理电压为64.56 kV、单次处理时间为148.60 s、处理频率为86.34 Hz，在此最佳条件下预测的杀菌率为100%，但为了实际操作简便，选取的最佳操作工艺条件为：处理电压为65 k V、处理时间为150 s、处理频率为86 Hz，以此条件实验重复三次取平均值，得到的杀菌率99.6%±2%，与预测值的相对误差较小，说明用该回归方程来分析和预测最佳杀菌率效果理想。经测定，处理后红枣内核温度为（11.6±1.1）℃，处理前的温度为（8.7±0.6）℃，处理前后温差较小。

2.3 DBD优化处理前后与传统冷杀菌处理红枣干果品质比较

由表4可知，经过DBD处理与传统冷杀菌方法—紫外辐照处理后的两组红枣样品，在感官指标（红度值、亮度值）以及品质指标（可溶性固形物、维生素C、可滴定酸和水分含量）均无显著差别，表明DBD和紫外辐照处理均不会对红枣干果品质造成影响。经过响应曲面优化的DBD最佳条件对菌落总数杀菌率最高可达99.6%，经紫外杀菌后检测杀菌率最高可达91.4%。结果表明，与紫外辐照杀菌相比，等离子体冷杀菌技术在用时更短的情况下具有更高的杀菌效果，且对处理后的品质无显著影响。

表4 红枣干果不同杀菌处理前后品质指标Table4 Quality index of dried jujube fruit before and after different sterilization treatment

2.4 DBD处理对红枣贮藏期内表面微生物数量的影响

在最佳处理条件下，红枣干果处理组与未处理组在贮藏期内表面微生物情况如图5所示。在整个贮藏期间红枣表面微生物数量呈现上升趋势，不同贮藏期内对照组红枣表面的菌落总数（图5A）、霉菌和酵母总数（图5B）、大肠菌群数（图5C）均显著（P<0.05）低于等离子体处理组；贮藏期内微生物超标情况参考企业干红枣标准[31]（菌落总数≤3 lg CFU/g、霉菌与酵母总数≤1.70 lg CFU/g、大肠菌群数≤1.45 lg MPA/100 g），由图5A和5B可知，贮藏0 d时，对照组的原始菌落总数、霉菌与酵母总数数量分别为3.15和2 lg CFU/g，已超过标准规定的数值，此时处理组残余的菌落总数为0.78 lg CFU/g，霉菌与酵母总数和大肠菌群未检测出，微生物数远远低于相关企业标准，等离子体处理组菌落总数、霉菌和酵母总数、大肠菌群数比对照组分别降低2.37、2.0 lg CFU/g和1.25 lg MPA/100 g；由图5B可知，当贮藏至60 d，处理组的霉菌与酵母总数为1.7 lg CFU/g，显著低于对照组的3.18 lg CFU/g，此时超过标准规定的霉菌与酵母总数。为进一步探究菌落总数和大肠菌群数超标的天数情况，对红枣干果的贮藏时间进行延长处理。当贮藏期至90 d时，处理组的大肠菌群数为1.48 lg MPA/100 g，超过标准规定的大肠菌群数限量；当贮藏期至105 d时，处理组干红枣的菌落总数为3.02 lg CFU/g，比对照组减少了1.85个lg CFU/g，已经超过标准规定的菌落总数限量。

图5 等离子体处理对红枣干果贮藏期内表面微生物数量的影响Fig.5 Effect of plasma treatment on surface microorganism of dried jujube during storage period

综上所述，等离子体处理可以有效抑制红枣表面霉菌和主要致病菌，延缓贮藏期内微生物的生长，减少霉变的发生，从而显著的延长红枣干果贮藏期，且可延长贮藏期50 d以上。

3 讨论

等离子体杀菌主要通过产生各种ROS（O3、NO2、H2O2、1O2等）对菌体产生氧化作用[32]，最终导致菌体死亡。处理时间的延长和处理电压的升高有利于产生更多活性物质，并使其对红枣表面的微生物作用更加充分，破坏细菌细胞膜的蛋白质，破坏细菌DNA，使微生物崩溃裂解，最终导致细菌的死亡[33]。本研究中，DBD设备对红枣杀菌作用随着时间的增加先上升后平缓，这一结果与Hu等[34]结果基本一致。推测当单次处理时间高于150 s时，密闭空气中产生的与红枣表面反应的活性物质浓度基本饱和。此外，当处理电压高于50 k V时，杀菌率随电压的升高而增长，这一结果与Kim等[35]研究结果较为一致，随着电压的升高，等离子体对猪肉病原菌的杀菌率也随之提高；但当电压高于71 kV后，红枣干果的杀菌率趋于平缓，推测是高电压情况下加剧气体碰撞,因电离状态不稳定,各类粒子进一步聚合或反应消耗，导致有效杀菌成分不再增加[36]。

本研究首次尝试运用频率因素探究对红枣干果杀菌率的影响，在一定范围内，杀菌率随处理频率升高而显著升高，与Takaki等[37]研究较为一致。当处理频率高于90 Hz时，杀菌率趋于平缓后呈下降趋势，但具体的原因还需进一步深入探究。多因素方差分析中显示频率因素对杀菌率无显著影响，处理电压与处理频率两因素的交互作用对杀菌率的影响是显著的，本文初探DBD设备处理频率和处理电压、处理时间的交互作用对红枣表面微生物降解效果，处于浅层研究阶段，是否继续深入研究频率因素对微生物的杀菌效能及机理是还需进一步实验研究和验证。

等离子体冷杀菌技术对于加工包装食品杀菌具有巨大优势，因其处理样品时可直接在包装内杀菌，减少手工及运输过程等产生的二次污染的可能性，方便快捷。同时处理后样品温升小，不会对产品品质产生影响，可以有效的延长包装食品的货架期，是一种极具商业价值的冷杀菌技术。

4 结论

低温等离子体对红枣干果的杀菌率在一定条件下随着工作频率、工作电压和工作时间的升高先显著（P<0.05）上升后趋于平缓；响应曲面优化的最佳条件为：工作电压为65 kV、处理时间为150 s、工作频率为86 Hz。在此最佳工艺条件下可使红枣干果表面菌落总数从3.15 lg CFU/g降到0.78 lg CFU/g，杀菌率达到99.6%。原始霉菌和酵母以及大肠菌群均未检出，并且不会对处理后的干红枣感官和理化指标有显著影响，综合杀菌保质效果优于紫外辐照。此外，等离子体杀菌处理后可以有效减缓红枣干果贮藏期内微生物数量的增加，可以显著地延长红枣干果贮藏期。