多功能免疫亲和柱净化-超高效液相色谱串联质谱法快速检测咖啡豆中的11种真菌毒素

陈悦铭，黄景初，徐 婷，林 虹，蔡伟谊，钟玉心，苏燕瑜，陈嘉欣，胡徽详，王 宇,,

（1.广州市食品检验所，广东广州 511400；2.广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528437；3.广东厨邦食品有限公司，广东阳江 529800）

真菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中在一定环境条件下产生的二级有毒代谢产物，这些毒素普遍具有免疫毒性、致畸毒性、致癌毒性等，危害很大[1−2]。因此，美国食药局（FDA）、欧盟（EU）、日本检验检疫等各国相关部门都颁布了食品中真菌毒素的相关规定。咖啡豆中赭曲霉毒素A（OTA）是欧盟监管的唯一一种真菌毒素（欧盟委员会条例，EC1881/2006），限量值为5.0μg/kg[3−4]。我国对咖啡豆中的毒素监管也仅限赭曲霉毒素A，限量值为5.0μg/kg[5]。然而，多项研究报道，咖啡豆的毒素污染存在于栽培、加工、运输和储存的各个环节中，包括赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马毒素、展青霉素、杂曲霉毒素等[6−10]。毒素污染是一个关系消费者健康的重要安全问题[11−16]，目前针对咖啡豆中真菌毒素的检测方法鲜有报道，为确保咖啡豆的质量安全，保障消费者身心健康，建立咖啡豆中的真菌毒素检测方法尤为重要。

目前，针对真菌毒素的检测方法主要包括薄层色谱法（TLC）[17]、液相色谱法（LC）[18]、荧光光谱法[19−20]、酶联免疫法[21]、气质联系用法（GC-MS）[22]、气相色谱法（GC）[23]和液质联用法（LC-MS）[24]。TLC法在确证新发现真菌毒素和检测方法研究方面具有一定的优越性，但由于精度低、操作复杂使其应用受到限制；荧光光谱法操作简便快速，但需要化学衍生，且易受基质干扰；酶联免疫法特异性强，灵敏度高，但每次只能检测1～3种毒素，检测通量低；GC-FID和 GC-MS技术主要应用于测定具有热稳定性、挥发性以及化学衍生的非挥发性真菌毒素，因此具有一定的局限性[25]；LC和LC-MS可用于大多数真菌毒素的分析，其因稳定可靠、灵敏度高及多组分同时检测等特点而受到广泛应用。特别是超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS），其专属性强、选择性好，灵敏度高和检测通量大，多用于真菌毒素检测分析领域。然而，我国现行有效的毒素检测方法标准共23个，其中涉及多种毒素检测的标准有2个，主要是针对粮油及其制品[3]，对于咖啡豆这种基质复杂的样品，目前并没有相应的检测方法标准。

本研究拟建立Oasis PRiME HLB串联复合免疫亲和柱-超高效液相色谱质谱联用法测定咖啡豆中的11种真菌毒素，对实验的质谱条件、流动相、色谱柱、净化方式等参数进行了优化，以期建立选择性好，灵敏度高，检测结果准确，快速定性定量，适用于咖啡豆多种真菌毒素的日常检测方法，为咖啡豆的质量安全提供有力的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 色谱纯，美国Fisher Chemical公司；氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠 分析纯，广州化学试剂厂；Oasis PRiME HLB净化小柱 美国Waters公司；Mycosep 224净化柱 美国RomerLabs公司；11+Myco MS-PREP多功能免疫亲和柱 拜发分析系统销售有限公司；标准物质 分别购于Romer Labs、Pribolab和TRC三家公司，具体的标物浓度见表1。

表1 标准品信息Table 1 Standards information

Waters Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司；SQP系列电子天平 赛多利斯（上海）贸易有限公司；Milli-Q®Reference超纯水机系统 法国Millipore（密理博）公司；MS3型涡旋混合器IKA®Works Guangzhou；Allegra X-30R高速离心机 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；2600TH超声波清洗器 上海安谱实验科技股份有限公司；Turbovap LV多样品自动浓缩仪 Biotage®Co.,Ltd.。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 提取溶液配制：乙腈-水-甲酸（85+14+1，V:V:V）；混合标准工作液与内标工作液的配制：准确吸取11种毒素标准品适量，11种毒素内标适量，用50%乙腈稀释至10 mL，得到混合标准溶液，于4℃冰箱中避光保存，具体浓度见表2。

表2 混标工作液与内标工作液浓度Table 2 Concentration of working solution with the internal stand working solution

1.2.2 样品的前处理 参照GB 5009.22-2016中的5.3.2的前处理条件进行了优化，具体如下：

1.2.2.1 样品提取 称取2.0 g粉碎后的样品，加入1 g氯化钠于50 mL的离心管中，混匀，加入10 mL乙腈-水-甲酸（85+14+1），涡旋振荡15 min，6000 r/min离心5 min，重复提取一次，合并提取液，取10 mL备用。

1.2.2.2 样品净化10 mL上清液过Oasis PRiME HLB，接净化液加入40 mL PBS磷酸缓冲溶液（7.0±0.1）稀释，50 mL稀释液过多功能免疫亲和柱（流速2 mL/min，或以重力自然速度通过免疫亲和柱），用20 mL水洗涤柱子，加压吹干，3.0 Ml 100%乙腈洗脱毒素（必须缓慢、稳定），收集洗脱液，45℃氮吹至干，用1 mL 50%乙腈复溶，过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，上LC-MS-MS分析。

1.2.3 色谱-质谱条件

1.2.3.1 LC条件色谱柱 Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）；流动相：A相：0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵溶液，B相：乙腈；柱温：40℃；进样量：5.0μL；梯度洗脱程序：0～1.0 min,10%B；1.0～4.0 min，10%～30%B；4.0～7.0 min，30%～60%B；7.0～8.5 min，60%～100%B；8.5～10.0 min，100%～10%B。

1.2.3.2 MS条件离子源 ESI源；离子源温度：150℃；质谱扫描方式：多重反应监测模式（MRM），分段扫描；加热气温度：600℃；脱溶剂气：1000 L/H；11种真菌毒素及其同位素内标的质谱条件参考表3。

表3 11种真菌毒素及其同位素内标的质谱参数Table 3 Optimized MRM parametersfor the determination of 11 mycotoxinsand internal standard

1.3 数据处理

方法重复性及回收率试验均做6次重复试验，采用Excel2016进行数据整理、分析，仪器数据采集软件为MassLynx4.1，数据分析软件为TargetLynx3.1

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化 真菌种类繁多导致所产的真菌毒素类型也多，据化学结构的不同主要分为刚性共面苯环结构（如黄曲霉毒素）、部分共面结构（如玉米赤霉烯酮和赫曲霉毒素）以及非共面倍半萜烯结构（如呕吐毒素和T-2毒素）3大类[26]。本研究中的11毒素在ESI＋、ESI−离子模式下是以[M+H]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]−、[M-H]−准分子离子峰出现[27]。质谱仪的锥孔电压和碰撞电压对方法灵敏度和离子丰度有很大影响。为选取合适的质谱参数，实验通过针泵恒流方式注入1.2.1配制的标准溶液进行分析，在ESI＋模式下考察11种真菌毒素及其内标的响应值，实验选取丰度响应高、特异性好的离子对，对11种真菌毒素及其内标进行质谱参数的优化，相关参数见表3。优化后的11种毒素及其内标离子流图见图1。

图1 11种真菌毒素标准溶液及其内标离子流图Fig.1 TIC chromatogram of 11 mycotoxins

2.1.2 流动相条件的优化 实验选择的真菌毒素理化性质差异大，流动相对目标物的峰型、响应、分离度和离子化效率有较大影响。经比较，毒素在乙腈中的响应值比甲醇强，且乙腈的洗脱能强、粘度小，能带来更高的柱效。因此，实验选择乙腈为有机相。

实验考察了流动相A中的甲酸体积分数（0.05%、0.10%、0.20%）和乙酸铵浓度（2、5 mmoL/L）对目标物的响应强度的影响，各目标物的色谱行为如图2所示。可以看出，当乙酸铵浓度为2 mmoL/L，甲酸浓度为0.10%时，目标物均能出峰，且响应值最高及灵敏度均较好。其余条件下，响应值及灵敏度均受影响，推测原因可能是正离子模式下0.10%甲酸可以提高待测物在电喷雾中的电离，提高方法灵敏度；加入2 mmoL/L的乙酸铵，能调节溶液的离子强度，改善待测物的峰形及响应强度，如T-2易与NH4+结合形成[M+NH4]+加合离子，质谱响应更稳定[28]。甲酸浓度<0.10%或甲酸浓度>0.10%与乙酸铵浓度>2 mmoL/L都会出现离子抑制的作用，不利于目标物的离子化。因此，本文选择0.10%甲酸+2 mmoL/L乙酸铵为水相。

图2 不同流动相对11种真菌毒素响应强度的影响Fig.2 Effect of different flow relative to the response strength of 11 fungal toxins

2.1.3 色谱柱的选择 实验考察了Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）、Capcell core C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×2.7μm）和Capcell core AQ色谱柱（100 mm×2.1 mm×2.0μm）3种色谱柱对11种目标物的分离效果。结果见图3，发现Capcell core C18色谱柱对伏马毒素B1的保留较弱，响应值较差，且对伏马毒素B2、B3无保留；Waters BEH C18和Capcell core AQ对11种目标物均有保留，但Waters BEH C18色谱柱是专门为扩散体积很低的 UPLC系统而设计的，它的填料粒径比Capcell core AQ色谱柱小，有更高的柱效，分析11种目标物的峰形和响应值优于Capcell core AQ色谱柱，对T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的分离度比Capcell core AQ色谱柱好，故本实验选择Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7μm）色谱柱进行实验分析。

图3 色谱柱的优化Fig.3 Optimization of the column

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 样品提取液体的优化 本实验考察了乙腈、乙腈-水（86+14）、乙腈-水-甲酸（85+14+1）3种不同提取溶剂与提取2次、3次对咖啡豆中的11种毒素提取效果的影响，回收率结果见表4。咖啡豆基质复杂，使用纯乙腈提取时，样品中的有机酸、有机醇类物质和脂溶性蛋白均能提取出来，PBS缓冲液稀释上免疫亲和柱时蛋白质容易析出，造成目标物的响应值和回收率偏低；加入一定比例的水能增加提取溶剂对样品的渗透性，提高目标物的萃取效率； p H影响部分酸敏感的真菌毒素的稳定性，为了提高毒素萃取效率，使用乙腈-水-甲酸（85+14+1）作为提取溶剂，11种目标物的加标回收率在80.2%～114%之间，结果见表4。实验发现提取2次与3次回收率无差别，为了减少前处理时间，选择乙腈-水-甲酸（85+14+1）提取2次作为实验条件。

表4 不同提取剂对真菌毒素的回收率Table 4 Recoveries rate of mycotoxins by different extractants

2.2.2 净化条件的优化 咖啡豆基质较为复杂，基质中的干扰物与目标物相互竞争电离或者目标物随基质共流出会造成目标物的响应值低且重复性差[29]，选择合适的净化方式可以最大程度去除干扰物，降低基质效应。咖啡豆富含天然色素以及咖啡因、钾、烟酸和维生素B3等生物活性物质，只使用多功能免疫亲和柱净化时，样品过柱效率低且容易堵柱，进行仪器分析时，因净化效果较差，有较强的基质效应，回收率也较串联双柱净化时差，故实验选择使用双柱净化的方式进行实验，单独使用多功能免疫亲和柱净化与双柱串联净化的净化效果对比见图4。实验比较了C18固相萃取小柱、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱、Mycosep 224净化柱串联多功能免疫亲和柱的净化效果，以各毒素的加标回收率为考察指标（如图5所示）。结果表明，使用C18固相萃取小柱时AFG2、ZEN、DON的回收率比较低，可能是其净化能力有限；使用Mycosep 224净化柱时，伏马毒素的回收率相对较差，可能是因为Mycosep 224净化柱填料对伏马毒素吸附作用；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱是一种新型的净化小柱，净化能力强，而且并不需要活化、淋洗和洗脱等复杂的前处理步骤，样液只需要直接通过小柱，接净化液就可进行下一步分析。使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱串联多功能免疫亲和柱净化时，各个目标物的响应值均较好，回收率在80%～120%之间，效果较好，因此选择Oasis PRiME HLB固相萃取小柱串联多功能免疫亲和柱作为净化条件。

图4 单柱净化与双柱净化效果比较Fig.4 Comparison of single column purification and double column purification

图5 不同净化方式对回收率的影响（n=6）Fig.5 Recoveries of 11 mycotoxins with different purification mode (n=6)

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围与检出限 配制11种真菌毒素的系列标准溶液，以目标化合物定量离子与其内标物峰面积之比对相应的质量浓度进行线性回归，以阴性咖啡豆样品为基质，加入标准溶液，以3和10倍信噪比对11种真菌毒素进行检出限和定量限的考察，结果见表5。11种目标物在各自浓度范围内线性关系良好，决定系数（R2）>0.998，检出限和定量限分别为0.008～0.544和0.01～1.63μg/kg，该方法线性范围良好、检出限低，能满足现行检测需求。

表5 11种真菌毒素的线性范围、相关系数、检出限与定量限Table 5 Linear range,correlation coefficient,LODs and LOQs of 11 fungal toxins(n=6)

2.3.2 回收率与精密度 分别添加三水平的11种混合标准溶液与阴性咖啡豆样品中，进行加标回收率试验，平行测定6次，计算平均回收率与相对标准偏差（RSD），结果见表6。结果表明，11种真菌毒素的平均回收率为80.2%～114%，相对标准偏差为1.4%～7.9%。

表6 咖啡豆中11种真菌毒素的回收率及相对标准偏差（n=6）Table 6 Recoveries and relative standard deviations of 11 fungal toxins in coffee bean (n=6)

2.4 实际样品检测

为了进一步验证方法的有效性，应用所建立的方法对市场上流通的20份咖啡豆样品进行检测。结果表明，1个批次的咖啡豆检出有AFTB1，污染水平为1.1μg/kg；2个批次检出有OTA，污染水平为6.8和5.3μg/kg，超出国家标准限量，其余毒素未检出。

3 结论

本研究建立了同时检测咖啡豆中11种真菌毒素的分析方法。样品经乙腈-水-甲酸提取，Oasis PRiME HLB柱串联多功能免疫亲和柱净化，氮吹、复溶后，采用多反应（MRM）模式检测，内标法定量，可以实现11种真菌毒素的同时检测。本方法准确可靠，操作快速简便，能满足咖啡豆基质中多种真菌毒素的检测需求，为咖啡豆质量安全监管提供了技术补充，也可为其它基质中多种真菌毒素的同时检测提供技术支持。