基于聚类分析的白茶高效液相色谱指纹图谱研究

王世博，宁洪鑫，黄龙岳，姚薛超，李祎亮，侯文彬,

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.北京协和医学院&中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192）

白茶为我国六大茶类之一，属于微发酵茶，主要产地为福鼎、政和、建阳和松溪，以福鼎白茶品质最佳[1−2]。白茶为我国特有品种，其制备工艺简单，有效地保留了茶叶中的营养成分，富含维生素，氨基酸、茶多糖、茶多酚、茶色素、黄酮、生物碱等，具有极高的营养价值[3−5]。现代研究表明白茶有很好的三降三抗（降血压、降血脂[6]、降血糖[7]、抗氧化[8−10]、抗肿瘤[11]、抗辐射[12−13]）的作用，还可以抗真菌[14]、解酒[15]、清除自由基[4]、调节神经紊乱[16]和延缓衰老[17]。

近年来白茶相关研究不断增加[5]，目前的研究主要有：白茶制备工艺[18−19]，化学成分组成与鉴定，白茶药理作用和衍生产品研究、开发[20−22]等。白茶质量控制和鉴别以感官评判为主，缺乏客观性。有学者将白茶作为组合研究对象，进行了香气成分鉴别[23]及指纹图谱初探[24−26]。关于白茶HPLC指纹图谱的系统研究尚不完善，其鉴别方法亟待提高。

本文采用中药指纹图谱与现代技术相结合的方法，对白茶多组分复杂体系进行质量评价[27]，可以提供丰富的鉴别信息，便于白茶及其衍生产品的开发与研究。试验主要收集12批不同品种、年份的白茶进行研究，建立白茶的高效液相的指纹图谱，对12批白茶进行成分分析和聚类分析，为白茶的质量控制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

12批白茶样品 按照GB/T30766-2014《茶叶分类》[28]标准进行处理，分别研磨过40目筛，放置于密封、干燥、温度20℃条件下储藏备用，样品的种类属性见表1；乙腈、甲醇 色谱纯，天津康科德公司；乙酸 色谱纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；表儿茶素没食子酸酯（ECG） 批号：111987-201501，中国食品药品检定研究所；表儿茶素（EC）批号：110878-200102，中国药品生物制品检定所；表没食子儿茶素（EGC） 批号：DST190703-038，乐美天医药德思特生物；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG） 批号：DST191107-036，乐美天医药德思特生物；没食子酸（GA） 批号：SDT190715-008，纯度≥98.0%，乐美天医药德思特生物；咖啡碱（CAF） 批号：C11693000，纯度≥98.0%，Ehrenstorfer，德国。

表1 茶叶样品生产信息Table 1 Tea sample production information

Waters 2695-2998高效液相色谱仪-二极管阵列检测器、Empower 3数据工作站 美国Waters公司；KQ2200E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SQP十万分之一天平 赛多利斯；AX124ZH万分之一天平 奥豪斯；纯水机 密理博；TD-5M低速离心机 四川蜀科仪器有限公司；HH-ZK-4智能数显恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 对照品溶液：称取咖啡碱20 mg，EC、GA、EGC、ECG、EGCG各10 mg置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。量取上述标准品储备液各1.0 mL于10 mL容量瓶，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，作为对照品溶液，备用。

供试样品溶液：称取茶叶样品0.2000 g置于10 mL离心管中，加入经70℃预热过的70%的甲醇5 mL，并于70℃水浴中浸提10 min，隔5 min搅拌一次，转移上清液于离心管中，残渣用5 mL的70%甲醇溶液提取，合并两次提取液放至室温，于3500 r/min条件离心10 min，取上清液置10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容，摇匀。取上述溶液2.0 mL置于10 mL量瓶，用70%甲醇定容，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，作为对照品溶液，备用[29]。

1.2.2 白茶指纹图谱建立 取12批白茶样品在“1.2.1”条件制备成供试样品溶液，进行高效液相色谱指纹图谱的分析。色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.5%乙酸；检测波长258 nm；柱温35℃；进样量10μL；检测时长60 min。洗脱程序见表2。以咖啡碱的色谱峰为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积比值。保存样品液相色谱图，并将数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件进行处理，生成相应的白茶高效液相色谱指纹图谱。

表2 高效液相色谱梯度洗脱程序Table 2 Program of HPLCgradient elution

1.2.3 指纹图谱方法学考察

1.2.3.1 咖啡碱线性关系考察 精密称取咖啡碱20 mg于10 mL容量瓶用70%甲醇定容，作为咖啡碱储备液。吸取咖啡碱250、500、750、1000、1250μL于10 mL容量瓶用70%甲醇定容至刻度，摇匀，制得含量为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g·L−1浓度的咖啡碱标准溶液，按“1.2.2”项条件下测定。

1.2.3.2 仪器精密度 称取白茶样品G9白牡丹，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，按“1.2.2”项条件下测定，连续进样6针，选取其中峰面积大的10个峰作为共有峰（下同），记录10个共有峰的保留时间和峰面积，以咖啡碱为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.3 稳定性考察 称取白茶样品G9白牡丹，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”项条件下测定，记录10个共有峰的保留时间和峰面积，以咖啡碱为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.4 重复性考察 称取白茶样品G9白牡丹6份，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，按“1.2.2”项条件下测定，记录10个共有峰的保留时间和峰面积，以咖啡因为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.5 高效液相色谱法的白茶指纹图谱相似度的计算12批白茶的样品在“1.2.1”项下制备供试品溶液，按“1.2.2”项条件下测定，记录茶叶样品在258 nm条件下的色谱图，并将数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”进行色谱峰匹配，色谱峰匹配条件设置为平均数法，时间窗宽度为0.5，通过多点校正进行峰匹配，并计算样品之间的相似度。

1.2.3.6 聚类分析 为进一步考察不同批次间的差异，采用系统聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）对12批次白茶的数据进行分析，观察不同批次白茶间的差异。在SPSS18.0软件中导入12批样品相对峰面积，聚类法采用组间均联法，选用夹角余弦为刻度距离作为分类依据[30]，分析不同白茶样品之间的亲疏程度。

2 结果与分析

2.1 提取方法与色谱条件选择分析

2.1.1 提取溶剂的选择 分别选择50%、60%、70%、80%、90%甲醇和50%、70%乙醇进行提取溶剂筛选，考察过程中发现采用50%、60%甲醇和50%乙醇时，白茶易漂浮于液面，浸提效果较差，故对70%、80%、90%甲醇和70%乙醇提取的样品进行液相色谱分析，结果如图1所示，提取溶剂选用70%乙醇时，色谱分离度和峰形欠佳，选用70%、80%、90%甲醇作为提取溶剂，其色谱图分离度和峰形俱佳，无明显差异，从提取成本和环保的角度考虑，未选用80%甲醇与90%甲醇，最终选用70%甲醇作为本方法的提取溶剂。

图1 不同提取溶剂考察的色谱图Fig.1 Chromatogramsof different extraction solvent

2.1.2 流动相的选择 理想的流动相可以更好地分离化合物，首先对比甲醇-水和乙腈-水两种流动相，如图2所示，可以看出乙腈-水作为流动相时色谱峰多，分离度好，进而在乙腈-水体系的基础上进行调整优化，采用乙腈−0.5%乙酸作为流动相进行考察，该条件峰形得到了进一步改善，最终确定本法流动相为乙腈−0.5%乙酸体系。

图2 不同流动相考察的色谱图Fig.2 Chromatograms of different mobile phases

2.1.3 流动相梯度考察 由于白茶提取成分多且复杂，性质差别较大，因此，实验选用梯度作为流动相的洗脱方式。对比了下述几种梯度条件，梯度条件见表3，结果如图3所示，可以看到图3d的色谱图中的色谱峰较多，峰形较佳，确定为本实验的梯度条件。

表3 高效液相色谱梯度考察Table 3 Program of HPLCgradient study

图3 不同梯度考察的色谱图Fig.3 Chromatogramsof different gradients

2.1.4 波长的选择 白茶中多酚类和生物碱类成分液相色谱的最大吸收波长多集中在270～280 nm之间，以270～280 nm为轴，选取240、258、270、280、300 nm几个波长，结果如图4所示，258 nm时基线平稳，色谱峰较多，容易分辨。经综合考虑确定以258 nm作为本方法的检测波长。

图4 不同波长考察的色谱图Fig.4 Chromatograms of different wavelengths

2.1.5 不同流速的考察 选取0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min，考察了不同流速对分析方法的影响，结果如图5所示，随着流速升高，出峰时间整体前移，流速在0.8 mL/min时出峰早，峰分离度较好。因此，本实验的液相方法中主体流速选择0.8 mL/min。

图5 不同流速的色谱图Fig.5 Chromatogramsof different flow rates

2.1.6 柱温的确定 经考察柱温为25、30、35℃时，色谱图如图6所示，色谱图未见明显差异，考虑到环境温度的变化等因素，最终确定柱温为35℃。

图6 不同柱温的色谱图Fig.6 Chromatograms of different column temperatures

2.1.7 参比对照峰的选择 参比对照峰的选择通常以保留时间和峰面积为指标，在指纹图谱的测定过程中发现咖啡碱保留时间居中，且峰面积较大，故选取咖啡碱作为参比对照峰。

2.2 指纹图谱方法学考察结果

2.2.1 咖啡碱线性关系 以峰面积为y轴，质量浓度为x轴求得回归方程为y=21031x+77833，r=0.9999，线性关系良好。

2.2.2 仪器精密度 精密称取样品G9，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，按“1.2.2”项条件下测定，记录10个共有峰的保留时间和峰面积，并以咖啡碱为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积。结果表明，选取的10个共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，色谱图在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对主要色谱峰进行匹配，相似度在0.999以上，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性考察 精密称取样品G9，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”项条件下测定，记录10个共有峰的保留时间和峰面积，并以咖啡碱为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积。结果表明选取的10个主要共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5%，色谱图在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对主要色谱峰进行匹配，相似度在0.999以上，表示稳定性较好。

2.2.4 重复性考察 白茶样品G9经粉碎后精密称取6份，在“1.2.1”项下制备供试品溶液，按“1.2.2”项条件下测定，记录10个共有峰的保留时间和峰面积，并以咖啡碱为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积。结果表明白茶色谱图中选取的10个共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，色谱图在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对主要色谱峰进行匹配，相似度在0.999以上，表明重复性良好。

2.3 指纹图谱的建立

将白茶样品所得的色谱图以AIA的格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，以G9为参照峰，进行色谱图叠加（图7），选择90%以上样本中的共有峰为样本的共有峰，在实验中以保留时间为18.23 min的11号峰（咖啡碱）为参照峰确立了28个共有峰（图8），各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，但各共有峰相对峰面积的值较大，说明不同品种、年份的白茶之间的差异较大（表4）。与对照品色谱图对比，指认出6个峰分别是峰2：GA；峰7：EGC；峰11：CAF；峰13：EC；峰14：EGCG；峰21：ECG（图8）。

图7 12份茶叶样品的HPLC指纹图谱Fig.7 HPLCfingerprints of 12 tea samples

图8 茶叶样品对照色谱峰Fig.8 Chromatographic peaks of tea sample control

2.4 相似度分析

将12批白茶样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”相似度软件，均值法生成指纹图谱的对照图谱。12批白茶样品与对照图谱的相似度在0.980～0.999之间，如表5，表明不同批次白茶成分组成一致，无显著性差异。

表5 茶叶样品的相似度Table 5 Similarity of tea samples

2.5 基于样品28共有峰相对面积的聚类分析

如图9所示，采用系统聚类分析法（HCA）对12批次白茶的数据进行分析，以峰11为参照峰计算28个峰的相对峰面积（见表4），将28个共有峰相对峰面积导入SPSS18.0软件，观察不同批次的白茶间的差异。聚类分析法采用组件均联法，选用夹角余弦为刻度。结果表明，聚类分析将12个样品分成了两类，其中G1和G2为一类，其他10个样品聚为一类。聚类分析表明各批次总体差异性较小，不同批次茶叶成分相对一致，差异较小，为白茶的研究奠定质量控制的基础，便于白茶及白茶相关产品的研究。

图9 12批茶叶样品系统分析树状图Fig.9 Dendrograms of cluster analysis on 12 batches of tea samples

表4 12批茶共有峰的相对峰面积Table 4 Relative area of common peaks in 12 batches of tea

3 结论与讨论

本文建立了白茶HPLC指纹图谱检测方法，经对12批不同品种、不同年份白茶进行HPLC指纹图谱研究，12批白茶样品与对照指纹图谱之间的相似度在0.98以上，说明12批白茶组成及含量基本一致，对图谱中GA、CAF、EC、ECG、EGCG、EGC六个峰进行成分确认。该方法准确、可靠，可为白茶的质量控制和深度开发提供参考依据。研究之初，同时考察了寿眉的指纹图谱，发现寿眉的某些儿茶素类成分如EGCG含量明显低于其他三种白茶。故本指纹图谱方法不适用于寿眉的鉴别。同时，本方法中共有峰多为茶多酚类物质，今后的研究中应关注到成分的广谱性加以进一步的考察。

通过对12批白茶样品相对峰面积的聚类分析中发现G1和G2在检测中被分为一类，分别为2013年的牡丹王和2014年的白牡丹，其他10种被分为一类。同时观察不同批次、种类白茶外观的差异，年份越久远白茶颜色越深，近几年的白茶多为青绿色，陈年白茶多为棕褐色，与聚类分析的结果具有一定的相关性。笔者推测，茶叶中的茶多酚在存放过程中逐渐被氧化，使其中一些儿茶素类成分含量降低，生成茶黄素，故外观相应发生变化。