拟南芥转录因子MYB54的体外纯化及功能初探

郑艺超，张 昊，，赵 丹，3，王凤茹，刘西岗，郭 琳

(1.河北师范大学 生命科学学院，分子细胞生物学教育部重点实验室，河北 石家庄 050000； 2.河北农业大学 生命科学学院，华北作物改良与调控国家重点实验室，河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北 保定 071001；3.衡水学院 生命科学学院，河北 衡水 053000)

MYB(v-MYB avian myeloblastosis viral)是一类在植物中普遍存在的转录因子。30 a前，人们从玉米(Zeamays)中鉴定出了第一个植物MYB基因-COLORED1(C1)，C1基因编码的MYB结构域蛋白是合成玉米糊粉中花青素所必需的蛋白[1]。从那时起，植物MYB基因的功能得到了人们的广泛关注。20 a前，拟南芥基因组序列发表，首次对植物MYB基因进行了全面的描述和分类[2]。之后MYB基因在拟南芥、玉米、水稻、矮牵牛花、金鱼草、葡萄、白杨、苹果和番茄等植物中的功能也通过遗传和分子分析得到了证实[3-4]。

MYB基因表达的蛋白具有高度保守的DNA结合结构域：MYB结构域，该结构域通常由至多4个重复序列(R1、R2、R3、R4)组成，每个重复序列包含52个氨基酸，能够形成3个α螺旋。并且每个重复序列的第二和第三螺旋会与3个规则间隔的色氨酸残基形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，其中色氨酸残基构成了三维HTH结构中的疏水核心[5]。MYB蛋白可分为1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB(4个R1/R2的重复)4种不同的亚类[6-7]。迄今分离出的大多数植物MYB基因编码的DNA结合域由2个重复序列构成，这2个重复序列与动物c-MYB蛋白的R2和R3重复序列最相似[8-10]。

研究发现，MYB基因是microRNA(miRNAs)和ta-siRNA(ta-siRNAs)的靶点[11]，同时MYB转录因子也是其他调控因子的直接靶点[12]。MYB转录因子在植物中可以发挥很多功能，例如调控初级和次级代谢，影响细胞生命活动，控制花青素和黄酮醇的生物合成[13]，调控植物生长发育[14]，参与植物对生物和非生物胁迫的响应等[15]。

迄今为止，人们已经研究和报道了很多MYB家族基因在拟南芥中的功能：AtMYB30被证明在控制下胚轴细胞伸长的油菜素内酯途径中发挥重要作用[16]；AtMYB60和AtMYB96能够通过ABA信号级联调控气孔运动[17]、干旱胁迫和抗病性[18]；AtMYB23与AtMYB5联合调控毛状体的伸长和分支[19-20]，AtMYB5还调控外种皮分化[21]；AtMYB16/MIXTA控制花瓣表皮细胞的形状[22]，和AtMYB17一起作为早期花序发育和种子萌发的调控因子[23]；MYB28和MYB29参与植物胺胁迫响应的调节[24]；AtMYB103调控纤维素的生物合成[25]；AtMYB61发挥多效作用，影响木质素沉积[26]、黏液生成[27]和气孔孔径[28]。之前的研究发现，AtMYB54参与了盐胁迫响应，在抗逆中发挥了一定功能。阐明MYB蛋白在生长发育和干旱胁迫的功能和调控作用，能够为预测MYB蛋白在小麦等其他植物物种中的功能提供坚实的基础。

本研究主要对拟南芥和小麦中MYB54在不同物种之间的保守性、蛋白结构、表达模式、高温胁迫进行了研究分析，并在拟南芥中对MYB54蛋白的诱导表达，转录活性进行初步探究，为MYB54在植物中的功能研究提供理论基础，以期能在作物产量应用中提供帮助。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究选择的植物材料为兰兹贝格(Landsberg erecta)野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)，载体构建所用的菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α，蛋白诱导所用的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，酵母菌株为Y2HGold，此材料都为刘西岗实验室保存。限制性内切酶、RNA反转录试剂盒与RT-PCR mix为Thermo公司购买，胶回收试剂盒为Biomiga公司购买。酵母转化试剂盒为北京Coolaber公司购买。

1.2 试验方法

1.2.1 MYB54的生物信息学分析 利用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站和TAIR网站(http：//www.arabidopsis.org)对MYB54的蛋白序列进行搜索，并将蛋白序列导入到https：//plants.ensembl.org/index.html网站中进行不同物种之间的同源对比，利用MEGA 10软件对不同物种之间的MYB54蛋白进行进化学分析。同时利用DNAMAN软件预测MYB54的蛋白质结构；利用同源模型服务软件SWISS-MODEL(http：//www.swissmodel.expasy.org/)预测MYB54蛋白三维空间结构。

1.2.2MYB54在拟南芥中的不同部位的表达量分析 选取16 h光照/8 h黑暗条件下生长了40 d的野生型拟南芥植株，取全根、莲座叶、茎生叶、花序以及果荚组织。利用TRIzol法提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA后进行RT-PCR检测，内参基因为UBQ5。反应总体系为10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45个循环；72 ℃制备溶解曲线。所用引物为表1所示。

1.2.3 高温和低温处理下拟南芥幼苗MYB54的表达量分析 将野生型Ler的种子用75%乙醇消毒后，铺在1/2MS培养基中，在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗条件下生长8 d后，将幼苗分别放入4，30 ℃进行高温和低温处理，2 h后全苗取样，进行RNA提取，反转录后利用RT-PCR测定MYB54的表达量。反应总体系为10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，内参基因为UBQ5。反应程序为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45个循环；72 ℃制备溶解曲线。所用引物为表1所示。

1.2.4 热胁迫下小麦中MYB54基因的表达量分析 将大小均一饱满的KN9204小麦种子，用2.5%次氯酸钠浸泡2 min，随后再用蒸馏水冲洗3次，冲洗干净后，均匀摆放在盛有蛭石的培养皿中，并将种子放入22 ℃培养箱中，在16 h光照，8 h黑暗条件中萌发，待小麦长至一叶一心时期在4 ℃进行春化处理28 d，随后将幼苗移栽进培养土中(营养土∶蛭石=1∶1)，在12 h光照(18 ℃)，12 h黑暗(13 ℃)进行培养，待幼苗长至两叶一心时，分别进行4 ℃冷处理和30 ℃热处理，处理2 h后全苗取材，随后利用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒获取cDNA进行RT-PCR检测，反应总体系为10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，内参基因为GAPDH。反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45个循环；72 ℃制备溶解曲线。所用引物为表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 MYB54蛋白相关表达载体的构建 利用snapgene软件对MYB54基因 CDS序列以及pGEX-4T-1，pGBKT7表达载体进行酶切位点分析，用EcoR Ⅰ和SalⅠ 2个酶切位点对目的基因和载体进行酶切回收，25 ℃条件下，用T4连接酶将MYB54基因 CDS序列与pGST-4T-1与pGBKT7载体连接，随后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中，加500 μL无抗LB培养液，并均匀涂布在氨苄霉素LB培养基上37 ℃培养12～16 h，挑取20个单菌落进行PCR鉴定，对鉴定出的阳性菌落提取质粒，利用BamH Ⅰ进行酶切验证，将酶切正确的重组质粒送金唯智公司(GENEWIZ)进行测序。

1.2.6 pGEX-4T-1-MYB54蛋白诱导纯化 考马斯亮蓝染色以及Western Blot检测 将构建好的pGEX-4T-1-MYB54重组质粒利用热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，37 ℃过夜培养。挑取单菌落加入5 mL氨苄抗性的LB培养液中，37 ℃摇床中220 r/min培育12～14 h，后转入250 mL的氨苄抗性的LB培养液中扩培4～5 h，待菌液OD600值达到0.6时加入IPTG，使其终浓度为0.3 μmol/L，分别在18 ℃过夜诱导，30 ℃诱导6 h，37 ℃诱导4 h。诱导结束后收集菌液，利用超声仪对菌液进行超声破碎，将超声后的上清加入GST凝胶树脂进行蛋白纯化，在4 ℃摇床中孵育4～6 h，将纯化出的GST-MYB54蛋白进行SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，并选取最适诱导条件下的纯化蛋白进行Western Blot检测。

1.2.7 MYB54在酵母中的转录激活活性分析 利用酵母双杂交系统对MYB54的转录活性进行分析，构建重组质粒pGBKT7-MYB54用于转化酵母菌株。首先将酵母菌株Y2HGold在YPDA固体培养基上划线，30 ℃倒置培养2～3 d，挑取直径2～3 mm的单克隆于3 mL YPDA培养液中，30 ℃，250 r/min摇床培养8 h，吸取100 μL～10 mL YPDA中，30 ℃，250 r/min摇床培养12～16 h，直至OD600达到 0.5左右。提前将1.5 mL离心管，枪头，ddH2O高温灭菌。用1.5 mL的离心管1 000 r/min离心2 min收集菌体2次，倒去上清并用1 mL无菌ddH2O重悬酵母；目的是洗去残留的YPDA培养液，再次室温1 000 r/mim离心2 min收集菌体，倒去上清并加入 1 mL 10× TE/LiAc，500 μL PEG8000和10 μL Carrier DNA 溶液重悬酵母；同时加入pGBKT7-MYB54重组质粒或pADT7空质粒作为对照。振荡混匀后30 ℃水浴 30 min，每 10 min 上下颠倒混匀1次。静置过夜后在42 ℃水浴锅中热激30 min，每10 min上下颠倒混匀1次。3 000 r/min离心5 min后，倒掉上清加入100 μL无菌水，重悬菌体后铺在SD-Leu/-Trp的培养基上，30 ℃培养2～3 d后，转接到SD-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基中继续培养3～4 d后，观察酵母生长状况。

2 结果与分析

2.1 MYB54系统进化树分析以及氨基酸序列对比

利用生物信息学软件，将拟南芥中的MYB54蛋白序列与欧洲油菜(Brassicanapus)、芥蓝(Brassicaoleracea)、白菜(Brassicarapa)、亚麻荠(Camelinasativa)、圆锥南芥(ArabisalpinaA)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianaattenuata)、水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)、小麦(Triticumaestivum)和番茄(Solanumlycopersicum)进行了蛋白同源性分析，如图1所示，拟南芥中的MYB54蛋白与十字花科中的芥蓝、白菜、亚麻荠等同源性比较接近，分别达到了87%，87%，81%，与禾本科植物高粱、谷子和水稻的同源性较低，分别为54%，57%，47%，与小麦和番茄的同源性为42%。同时，通过图2中MYB54的氨基酸序列比对可以看出，在不同物种之间，MYB54具有非常保守的一段氨基酸序列，这段序列包含20个氨基酸片段，位于MYB-like DNA-binding 结构域之中。

图1 系统进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis

2.2 MYB54氨基酸序列的生物信息学分析

小麦作为我国主要的粮食作物之一，其中基因功能的研究对小麦育种具有重要的意义和价值，随后笔者利用 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站对MYB54蛋白分别在拟南芥和小麦中的氨基酸序列进行分析比对，结果如图3-5所示，拟南芥中MYB54蛋白具有243个氨基酸，相对分子质量为28.169 ku，等电点为10.17。小麦中MYB54蛋白具有275个氨基酸，相对分子质量为29.881 ku，等电点为10.005 4，对比图3-A、B可以看出，MYB54在小麦和拟南芥中存在非常保守的蛋白结构域，例如MYB-like DNA-binding结构域，该结构域在小麦和拟南芥中都存在，包含MYB蛋白的DNA结合结构域，以及与核小体滑动相关的SANT(“SWI3，ADA2，N-CoR and TFIIB”)结构域[29]。用同源模型服务软件 SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)分别对拟南芥和小麦中的MYB54蛋白进行三维空间结构的预测，结果如图4-A和图5-A所示。拟南芥中MYB54蛋白在第84位疏水性最高，峰值为2.15，在第157位亲水性最高，峰值为-1.71，结合ProtPram预测的平均亲水性为0.03，分析可知该蛋白为亲水性蛋白。小麦中MYB54蛋白在第1位疏水性最高，峰值为2.83，在第82位亲水性最高，峰值为-1.58，平均亲水性为0.04，预测为亲水性蛋白。同时对拟南芥和小麦中MYB54蛋白的二级结构进行预测，拟南芥MYB54蛋白包含96个螺旋，36个折叠，111个卷曲。小麦MYB54蛋白包含87个螺旋，48个折叠以及140个卷曲(图4-B-D和图5-B-D)。综合以上数据，可以看出小麦中MYB54蛋白与拟南芥中MYB54蛋白在保守结构域、亲水性、二级结构以及三级结构都十分相似，所以对拟南芥中MYB54蛋白的研究能够为预测小麦中MYB54蛋白功能提供有力的理论依据。

图2 MYB54氨基酸序列同源对比Fig.2 MYB54 amino acid homology comparison

A.拟南芥MYB54蛋白序列；B.小麦MYB54蛋白序列。A. Arabidopsis MYB54 protein sequence；B. Wheat MYB54 protein sequence.

A.蛋白质三级结构预测；B.疏水性预测；C.亲水性预测；D.蛋白质二级结构预测。图5同。A.Prediction of tertiary structure of proteins；B.Hydrophobicity prediction；C. Hydrophilicity prediction；D. Protein secondary structure prediction；The same as Fig.5.

图5 小麦MYB54蛋白质生物信息学分析Fig.5 MYB54 protein bioinformatics analysis in wheat

2.3 MYB54基因在拟南芥不同组织的表达量分析

以拟南芥野生型(Ler)为材料，利用RT-PCR分别对根、莲座叶、茎生叶、花、果荚中的MYB54表达量进行分析，结果如图6所示，在这些组织中MYB54均有表达，但在果荚中的表达量最高，在花序和根中的表达量次之，在莲座叶和茎生叶中的表达量最少。综合以上结果，猜测MYB54可能在生殖发育过程中起着重要的作用。

2.4 拟南芥MYB54基因在高温和低温处理下的表达量分析

对野生型幼苗进行高温和低温处理，2 h后检测MYB54基因的表达量，结果如图7所示，高温处理后，MYB54基因的表达显著降低，表明MYB54能够响应高温胁迫，而在低温处理后，MYB54基因的表达量与对照组没有显著差异，这与前人在热胁迫中MYB54功能的研究相印证。

2.5 小麦MYB54基因在高温和低温处理下的表达量分析

随后对两叶一心时期的小麦幼苗进行高温和低温处理，2 h后检测了MYB54基因的表达变化，结果如图8所示，高温处理之后，MYB54的表达量与对照组相比下降1/2，低温处理之后，MYB54的表达量与对照组相比没有显著差异，这些结果与拟南芥中MYB54基因的变化趋势一致，表明MYB54对热较敏感，高温可以抑制MYB54的表达。

n=3，采用t检验分析数据的显著性；不同字母表示数据之间差异显著(P<0.05)。图7-8同。

图7 高温和低温胁迫下拟南芥MYB54基因的表达Fig.7 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in Arabidopsis

图8 高温和低温胁迫下小麦MYB54基因的表达Fig.8 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in wheat

2.6 MYB54蛋白的诱导纯化以及Western Blot分析

为了探索pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白的最适诱导纯化条件，分别在18，30，37 ℃对该蛋白进行诱导，之后通过凝胶电泳和考马斯亮蓝染色对诱导纯化结果进行分析。MYB54蛋白分子量大小约为27 ku，GST蛋白分子量大小约为26 ku，故融合蛋白分子量大小约为53 ku。结果如图9所示，18，30，37 ℃条件下，蛋白都可以被正常诱导(泳道2-4)，并且在超声后的上清液(泳道5-7)和沉淀中(泳道8-9)都可以检测到融合蛋白，随后将蛋白利用GST凝胶树脂进行纯化，结果发现，在37 ℃条件下纯化出的蛋白数量更多(泳道13)。随后对37 ℃条件下纯化出的融合蛋白利用GST抗体进行Western Blot检测，结果如图10所示，pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白可以正确的表达翻译。

2.7 MYB54转录激活活性分析

MYB54作为转录因子来发挥功能，转录因子具有转录激活或转录抑制活性，为了验证MYB54的转录激活活性，利用了酵母双杂交GAL4系统进行验证，GAL4含有DNA结合结构域(DNA-Binding domain)BD和转录激活结构域(Transcription-activating domain)AD。将MYB54基因的CDS连接到pGBKT7载体上，构建了MYB54-BD，如果MYB54蛋白具有转录自激活活性，即使没有与其他蛋白质相互作用也可以启动下游报告基因的表达。将构建好的MYB54-BD与不带有其他表达蛋白的空AD共同转入酵母中，在四缺培养基中进行培养，结果如图11所示，MYB54-BD与空AD依然能够在四缺培养基上生长，空AD和空BD不能在四缺培养基上生长，这一结果表明MYB54在酵母中具有转录激活活性。

M.蛋白Marker；1.蛋白诱导前；2-4.分别在18，30，37 ℃条件下诱导后的蛋白；5-7.分别在18，30，37 ℃条件下诱导后蛋白的超声上清；8-10.分别在18，30，37 ℃条件下诱导后蛋白的超声沉淀；11-13.分别在18，30，37 ℃条件下纯化的蛋白。

M.蛋白Marker；1.GST凝胶树脂；2.纯化的GST-MYB54蛋白。M.Protein Marker；1.GST gel resin；2.Purified GST-MYB54 protein.

图11 酵母双杂交系统检测MYB54基因自激活活性Fig.11 Yeast two-hybrid system to detect the self-activating activity of MYB54 gene

3 结论与讨论

MYB蛋白包含了非常保守的MYB DNA-binding结构域，该结构域通常由至多4个重复序列(R1、R2、R3、R4)组成，植物中MYB相关蛋白通常包含2个螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，即R2和R3重复序列[30]。据估计，拟南芥含有超过100个R2R3-MYB基因。功能数据表明，这些基因在次级代谢的调节、细胞形状的控制、抗病性和激素反应中发挥重要作用。对拟南芥中MYB蛋白家族的MYB54蛋白进行了研究，研究发现，拟南芥中的MYB54蛋白与十字花科的同源性比较接近，与禾本科植物的同源性较低。MYB54蛋白在小麦和拟南芥中的保守结构域、亲水性、二级结构以及三级结构都十分相似，因此，探明模式植物拟南芥中MYB54蛋白的功能对小麦等农作物的研究具有重要的参考意义。MYB54基因在根、莲座叶、茎生叶、花、果荚中均有表达，暗示该基因在植物各个部位的生长发育都可能起到一定的调控作用，但在果荚中的表达量最高，因此，猜测MYB54可能在生殖发育过程中起着重要的作用。拟南芥和小麦中，经过高温处理后，MYB54的表达量都显著降低，这也暗示着MYB54在对热胁迫的响应中发挥着重要功能。MYB54蛋白的诱导条件并不严格，在18，30，37 ℃温度条件下，都可以被成功诱导，但在37 ℃温度下纯化的蛋白数量更多，Western Blot检测表明MYB54蛋白可以在体外正确翻译表达。利用酵母GAL4体系发现MYB54作为转录因子，具有转录激活活性。拟南芥MYB基因家族中依然有90%的MYB基因功能尚未被完全了解，对MYB54蛋白进行了基础的研究和初步的探索，以期为发掘更多的MYB蛋白家族功能提供理论基础和参考指导。