段绍凤,朱春艳,余成华,梁艳丽
(1.云南农业大学,西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心,云南 昆明 650201;2.云南农业大学,云南省药用植物生物学重点实验室,云南 昆明 650201;3.云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650201)
传粉是种子植物完成生殖过程的必经过程,很大程度上影响着基因流和群体之间的交配模式,在有性繁殖方式中决定着上一代基因对下一代遗传的表现和适合度[1]。在植物有性繁殖过程中,开花特性与其传粉机制相适应,且有效传粉要具备大量有活性的花粉、有效的传粉媒介和具有强可授性的柱头[2-3]。花粉活力[4-7]和柱头可授性[8-9]共同影响着传粉成功率[9],且花粉活力保持时间的长短和柱头可授性期的长短结合在一起,会严重影响异花传粉植物的传粉成功率。
滇龙胆(Gentiana rigescensFranch.)为龙胆科(Gentianaceae)多年生草本植物,主产于中国云南和四川等地,具有保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗氧化和促神经活化等功效[10-14],随着其药用价值被不断发掘,市场需求量不断攀升。前人研究主要集中在滇龙胆的居群、资源分布及有效活性成分上[15-16],而对滇龙胆访花昆虫和花粉活力研究还未见报道。本研究通过对滇龙胆花粉活力、花粉粒形态、柱头可授性、传粉者及访花行为等进行观察测定,明确滇龙胆的传粉生物学特征,对揭示滇龙胆植物的有性生殖规律具有重要意义,同时可为滇龙胆的进化及遗传特性研究奠定理论与实践基础,为滇龙胆资源保护和引种栽培提供参考。
试验地位于云南省临沧市云县漫湾镇(N23°56′~24°46′,E99°43′~100°33′),海拔2 200 m,属北亚热带气候,降水主要集中在7—9 月,年降雨量1 367.2 mm,土壤以沙壤土为主。2018 年10—12 月和2019 年10—12 月对栽培的三年生滇龙胆进行观察测定并记录。
为分析比较测定滇龙胆花粉活力的最佳方法,分别采用氯化三苯基四氮唑染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI 染色法和过氧化物酶法进行检测,每种试验方法均设置3 次重复。
1.2.1 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法
取30 朵单花的花粉置于普通载玻片上,滴入2 滴质量分数为0.5%的TTC 溶液,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,于25~28 ℃下放置15~20 min。在4 倍显微镜下观察5 个不同视野,被染成红色的均为有生活力的花粉粒。
1.2.2 醋酸洋红染色法
取30 朵单花的花粉放在载玻片上,并滴入2 滴醋酸洋红溶液,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,片刻后在4 倍显微镜下观察5 个不同视野,有活力的花粉被染成红色。
1.2.3 碘—碘化钾(I2-KI)染色法
取 30 朵单花的花粉于干净的普通载玻片上,加1 滴水,使花粉散开,再加1 滴I2-KI 溶液,盖上盖玻片,置于4 倍显微镜下观察5 个不同视野并计数,被染成蓝色且有活力的花粉粒。
1.2.4 过氧化物酶法
配制试剂I:0.5%联苯胺、0.5% α-萘酚和0.25%碳酸钠各10 mL 混合均匀。取30 朵单花,把花粉放在干净载玻片,加试剂I 和0.3%过氧化氢各1 滴,搅匀后盖上盖玻片,将制片放置于30 ℃恒温箱中10 min,然后置于显微镜下观察5 个不同视野,统计被染为红色的花粉数量。
1.2.5 花粉活力动态变化检测
采用1.2 节筛选出测定滇龙胆花粉活力的最佳方法,测定滇龙胆开花前1 d 到开花后第6 天花粉活力以及开花当天花粉活力的变化。
采集正在开放、花药成熟的新鲜花朵10 朵,取其花药并用卡诺固定液固定;同时,把蜜蜂身上携带的花粉抖下来装入离心管,用卡诺固定液固定带回实验室。取出花粉,真空干燥、离子溅射镀金膜后用FEIQUANTA 200 扫描电子显微镜观察并拍照。
用联苯胺—过氧化氢法测定柱头可授性。每天 10:00—14:00 采摘开花前4 d 和开花后6 d的花朵,每隔1 h 分别取60、60、60、52 和38 朵花,也就是从始花期开始测定柱头可授性直至花开始萎蔫。先从花朵中把柱头取出,在解剖镜下小心将子房剥离出来,并浸入含有反应液(V1%联苯胺∶V3%过氧化氢∶V水=4∶11∶22)的凹面载片凹陷处。根据反应液颜色、气泡的数量和大小判断柱头可授性的相对强弱。若反应液无颜色变化,没有或仅有极少数气泡冒出,说明柱头无可授性;若反应液呈蓝色并有极少的气泡冒出,说明柱头有可授性,但可授性非常弱;若反应液为蓝色并有较多的气泡冒出,说明柱头可授性很强[17]。
于滇龙胆盛花期(11 月初),选择晴朗天气对视线范围内10 个1 m×1 m 的样方连续观察3 d,每天7:00—19:00,每隔1 h 在固定样方间断性的观察记录访花昆虫的数量和种类并拍照记录[18]。对每种昆虫的访花行为进行视频记录,并用捕虫网捕捉昆虫带回室内鉴定。在观察时间内,凡是访问特定(即访问频率高)滇龙胆植株花朵的昆虫均跟踪记录,分别记录其访花行为以及访花频率或访花者活动频率[19]。
数据采用SPSS、GraphPad Prism 8 和Excel处理,显著性方差分析利用LSD 法。
由图1 可知:4 种测定滇龙胆花粉活力的方法中,过氧化物酶法测定的花粉活力为65.98%,显著高于其他3 种方法 (P<0.05)。因此,最适合的滇龙胆花粉活力测定方法为过氧化物酶法。
图1 不同测定方法下滇龙胆花粉活力)Fig.1 Pollen viability of G.rigescenss under different determination methods
采用过氧化物酶法测定滇龙胆开花前1 d 到开花后第6 天花粉活力的变化,结果(图2)显示:滇龙胆花粉活力呈现先上升再下降的趋势,并于开花后第3 天花粉活力达到最高(65.98%),开花后第6 天花粉活力最低(12.00%)。
图2 不同时间滇龙胆花粉活力变化)Fig.2 Comparison of pollen viability of G.rigescenss at different time
开花当天,花粉活力呈现出规律性的变化。8:00 时花粉活力最低;随后开始显著升高,14:00 时达到最高,达64.71%;之后花粉活力开始显著下降,18:00 时花粉活力降至最低(图3)。
图3 1 天内花粉活力变化)Fig.3 Changes in pollen viability during a day
滇龙胆花粉粒外观呈球形,赤道面观为椭圆形,两端平截;近极面和远极面相同,均为三裂圆形(图4)。滇龙胆花粉粒具有3 条萌发孔沟,极轴走向等间距赤道分布,沟长裂至两极,沟的末端在极面上不连接形成合沟。按照G.埃尔特曼[20]的NPC 分类系统,属于N3 型花粉,即赤道三孔沟类型。花粉外壁条纹形成网格状。对访花频率最高的蜜蜂身上的花粉进行花粉粒测定,发现蜜蜂携带的花粉跟滇龙胆的花粉一致(图5)。
图4 不同角度花粉粒形态)Fig.4 Pollen grain morphology from different angles
图5 花粉粒形态)Fig.5 Pollen grain morphology
从始花期直至花开始萎蔫,柱头可授性强弱及形态变化发生明显变化(图6)。在花蕾末期时柱头呈尖状,有微弱的柱头可授性;始花期时柱头开始分裂;盛花期时柱头有较强的可授性,分叉成“Y”形;末花期时柱头可授极强,单花萎蔫时,无柱头可授性,分叉成羊角状。
图6 柱头可授性及形态变化)Fig.6 Stigma acceptability and morphological changes
由表1 可知:在开花当天,柱头活力极弱,可记为无可授性;在开花第2 天,开始出现极低可授性;在开花第3 天,出现较强柱头可授性,为15.00%,在开花第4、5 天,出现极强柱头可授性,可授性分别达57.69%和63.16%。
表1 柱头可授性检测结果Tab.1 Results of stigma acceptability test
定点观测发现:滇龙胆的访花昆虫主要有蜂类和蚁类,其中蜜蜂为主要传粉昆虫,其他访花者很少。视频记录访花行为:采蜜,花药掉落,柱头未伸出花冠管的花序;采粉,开放1/4~1/3的花序类型;采蜜兼采粉,传粉者主要访问的花序类型为正在开放花序,且柱头并未伸出花冠管;采蜜兼授粉,主要存在于柱头全部伸出花冠管的花序上;休憩,主要存在于未开放的花序或叶片上。
由图7 可知:访花蜜蜂的数量变化呈单峰曲线,9:00 开始出现访花蜜蜂;随着温度的升高和湿度的降低,从10:30 开始访花蜜蜂快速增多,11:30—12:30 之间出现访花高峰期,此时也为昆虫出现高峰期;12:30—14:30 之间访花者数量下降,可能是因为过高的气温影响访花者活动;15:30 之后出现明显下降的现象,直至19:00 没有观察到访花昆虫。
图7 主要访花昆虫(蜜蜂)日活动规律)Fig.7 Daily activity pattern of main pollinatiors (bees)
植物花粉活力持续时间受遗传因素和环境因子的影响[21-23]。李娅琼等[24]采用联苯胺—过氧化氢法测定了滇龙胆的花粉活力。为了使试验更准确,本研究对花粉活力测定的方法进行了比较研究,发现用TTC 法、醋酸洋红法和I2-KI 法测定的花粉活力都比较低,可能是由于花粉块的膜没有充分破坏,使得花粉没有完全散开,也有可能是滇龙胆花粉块的特殊结构和含有特殊成分使得这3 种方法不适合其花粉活力的测定。本研究中过氧化物酶法的染色率最高,而且各重复之间差异不明显,所以过氧化物酶法能准确地反映滇龙胆的花粉活力,可作为测定滇龙胆花粉活力最适宜的方法。这与对青蒿[25]和蜡梅[26]等植物的研究结果一致。
通过对花粉活力的动态变化进行研究发现:滇龙胆在开花后第3 天花粉活力达到最高值,而其柱头可授性却在开花的第4~5 天达到最高值,因此表现为雌雄异熟中的雄先熟,花药开裂时间与柱头可授粉之间存在时间间隔。雌雄异熟有利于减少自交,提高异交率,从而提高后代对环境的适应能力,同时也说明滇龙胆繁育系统趋向于异交型,需要传粉者。
传粉者对需要传粉媒介的开花植物起关键作用。昆虫主要通过视觉、嗅觉和短程的触觉等被花吸引,吸引强度取决于花的形状、大小和颜色以及花蜜的挥发强度和昆虫的感知[19]。在长期的进化中,昆虫与植株形成了一种互利关系,昆虫在采食花蜜和花粉的同时也为植物的繁育提供帮助[27]。本研究发现:蜜蜂为滇龙胆的主要访花昆虫,11:30—12:30 是其访花高峰期。通过对其访花行为的观察,发现它们在采蜜时可携带滇龙胆花粉,说明蜜蜂可为滇龙胆进行有效传粉,为滇龙胆的传粉昆虫。在滇龙胆栽培制种过程中,应注重保护基地周围蜜蜂资源。
本研究明确了滇龙胆传粉生物学特征,即最适合测定其花粉活力的方法为过氧化物酶法;开花后第3 天其花粉活力最高,开花第4、5 天柱头可授性达到最强;其花粉属于N3 型花粉;最主要传粉昆虫是蜜蜂。本研究对滇龙胆的有性生殖规律具有重要意义,可为滇龙胆资源保护和引种栽培提供参考。