39株指/趾甲分离黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种鉴定和抗真菌药物敏感性

许雪 邓淑文 王晓东 赵蓉芬 张虹 于农 Mohammad Javad Najafzadeh 史冬梅 陆敏

(1. 苏州高新区人民医院检验科，苏州 215000；2. 新疆医科大学第一附属医院皮肤科，乌鲁木齐 830011；3. Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran；4. 山东济宁市第一人民医院皮肤科/医学真菌学实验室，济宁 272000)

甲真菌病是一种常见的由真菌引起的甲感染，病原体包括皮肤癣菌、酵母菌和非皮肤癣菌丝状真菌(non-dermatophytes mold，NDM)。近年来，NDM所致甲真菌病(non-dermatophytes mold onycomycosis，NDMO)的发病率不断增加[1-2]。曲霉作为非皮肤癣菌丝状真菌(NDM)，引起NDMO的报道逐渐增多[3-4]。随着分子检测技术的发展，曲霉属中许多新的菌种被报道可引起甲真菌病[2,5]。Bongomin[3]综述了全球42篇甲真菌病流行病学文献，发现超过50%(23/42)的研究报道了曲霉属菌种可作为甲真菌病的病原菌，占NDMO的50%～100%。在伊朗，既往研究表明曲霉可引起NDMO，且主要致病菌种为黄曲霉(AspergillussectionFlavi)。但值得注意的是，伊朗大多数研究报道中，菌种鉴定主要是基于形态学鉴定，且关于分离菌株体外抗真菌活性的研究数据很少。由于形态学鉴定并不能区分曲霉属的近缘种(如AspergillussectionFlavi菌种)，而准确的曲霉属菌种鉴定对临床选择最佳治疗方案和判断疾病预后具有重要作用。

Calmodulin(CaM)或β-tubulin(BenA)基因的部分序列是目前鉴定曲霉属菌种，尤其曲霉复合体菌种的推荐鉴定基因[6]。此外，最近的研究表明，MALDI-TOF质谱鉴定可以作为基于DNA序列鉴定曲霉菌种的替代方法[7-8]，尤其是对一些曲霉同形种(cryptic species)，或者是分子鉴定不能区分的曲霉属菌种[7]，例如A.flavus/A.oryzae，MALDI-TOF质谱有能力将其区分开[9]。

因此，本研究对伊朗马什哈德地区甲真菌病患者指/趾甲分离基于形态学鉴定的39株AspergillussectionFlavi菌株进行分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定。同时，对这些菌株进行了包括特比萘芬在内的10种抗真菌药物的体外抗真菌活性检测。

1 材料与方法

1.1 菌种鉴定

39株AspergillussectionFlavi菌株分离自伊朗马什哈德地区Emam Reza & Ghaem医院诊断为甲真菌病患者的指/趾甲。曲霉菌属引起的甲真菌病的诊断标准根据文献[3]满足以下3点：①直接镜检阳性；②同部位反复培养或分子检测为曲霉；③未分离出皮肤癣菌。该研究获得了Mashhad医学科学大学伦理委员会的伦理认可和伦理规范(IR.MUMS.MEDICAL.REC.1397.660)。所有患者都理解并同意将其临床标本用于本研究。

1.2 分子鉴定

39株AspergillussectionFlavi菌株在SDA培养基于35℃培养4～5 d后，采用CTAB法提取菌株基因组DNA[10]。菌种鉴定采用Calmodulin (CaM)和β-tubulin(BenA)基因测序，引物序列参见表1。测序获得的序列与GenBank数据库(BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和荷兰真菌多样化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉专业数据库进行比对，鉴定到菌种水平。

表1 本研究使用引物名称及序列

1.3 MALDI-TOF 质谱鉴定

39株AspergillussectionFlavi菌株在SDA培养基上于35℃培养4～5 d后，采用安图生物公司MS1000 MALDI-TOF质谱鉴定进行菌种鉴定。鉴定方法参照说明书，即挑取适量曲霉孢子置于含1 mL 75%酒精的离心管中，混匀后以15 000 rcf离心5 min。弃去上清液，在恒温金属浴(Thermo Fisher Scientific, California, United States)上干燥残留物，然后加入40 μL裂解液1并反复吹打使之产生气泡，取1 μL滴于靶板上，在生物安全柜中自然干燥，然后再吸取1 μL基质溶液于靶板的相同位置，在生物安全柜中自然干燥。最终，使用AUTOF MS1000质谱仪对产生的质谱进行积分鉴定。

1.4 抗真菌药敏试验

参考CLSL M38-A3方案[11]，抗真菌药物包括：阿尼芬净(ANF)、卡泊芬净(CAS)、米卡芬净(MFG)、两性霉素B(AmB)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(POS)、雷伏康唑(RAV)、艾沙康唑(ISA)和特比萘芬(TER)。其中，米卡芬净购自多伦多研究化学品公司，特比萘芬购自阿拉丁生化科技公司，其余抗真菌药物均购自Sigma。以C.parapsilosisATCC22019 和A.fumigatusATCC MYA-3627 为质控菌株。所有待测菌株在SDA琼脂平板35℃培养4～5 d，以进行菌株活化。取适量孢子于装有1 mL无菌生理盐水的研磨器中充分研磨，显微镜下通过计数板计算菌悬液的初始浓度并通过RPMI 1640培养基将菌悬液的最终接种浓度调整为(0.4～5)×104CFU/mL，然后置于96孔药敏板中。棘白菌素类(米卡芬净、阿尼芬净和卡泊芬净)抗真菌药的浓度范围为0.008～4 mg/L，而其他抗真菌药的浓度范围为0.031～16 mg/L。棘白菌素类药敏板于35℃下培养24 h后观察结果，其他培养板则在35℃下培养48 h。用显微镜(Olympus, Japan)在×40倍放大率下测定最低抑制浓度(MIC)和最低有效浓度(MEC)。表2列出了10种抗真菌药物的药物浓度范围、MIC/MEC读数时间和黄曲霉流行病学临界值(epidemiological cutoff values, ECV)。

表2 本研究中检测10种抗真菌药物的浓度范围、MIC/MEC读数时间、ECV

2 结 果

2.1 菌种鉴定

以GenBank 数据库(BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和荷兰真菌多样化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉专业数据库为参考数据库，对根据CaM和BenA基因序列BLAST比对分析，基于形态学鉴定的39株AspergillussectionFlavi菌株，38株为A.flavus/A.oryzae，1株为A.minisclerotigenes。采用安图生物MS1000 MALDI-TOF 质谱仪，对39株AspergillussectionFlavi菌株进行MALDI-TOF质谱鉴定，结果均为A.flavus，鉴定结果见表3。

表3 39株Aspergillus section Flavi分子鉴定和MALDI-TOF MS鉴定结果

2.2 药敏结果

表4列出了39株AspergillussectionFlavi对10种抗真菌药物MIC/MEC值的范围、MIC90、GM、Modal MIC 及MIC/MEC分布。

表4 39株Aspergillus section Flavi对10种抗真菌药物MIC/MEC值的范围、MIC90、GM菌株分布

38株A.flavus对10种抗真菌药物的Modal MIC和 GM(mg/L)值依次为(递增顺序)米卡芬净(0.008)、阿尼芬净(0.008)、特比萘芬(0.03)、泊沙康唑(0.097)、卡泊芬净(0.142)、艾沙康唑(0.274)、伏立康唑(0.274)、伊曲康唑(0.311)、雷伏康唑(0.394)、两性霉素B(2.151)。

1株A.minisclerotigenes对10种抗真菌药物的MIC/MEC(mg/L)值分别为(递增顺序)：米卡芬净(0.008)、阿尼芬净(0.008)、特比萘芬(0.03)、N：没有鉴定结果。

卡泊芬净(0.125)、伏立康唑(0.25)、艾沙康唑(0.25)、伊曲康唑(0.25)、雷伏康唑(0.5)、泊沙康唑(0.5)、两性霉素B(1)。

3 讨 论

本研究报道了伊朗马什哈德地区致甲真菌病的AspergillussectionFlavi菌种的分子特征以及其对10种抗真菌药物的体外敏感性。

研究结果表明A.flavus是伊朗马什哈德地区AspergillussectionFlavi引起甲真菌病的主要菌种。在伊朗，已有研究报道曲霉属菌种(主要是AspergillussectionFlavi)是NDM致甲真菌病的常见致病菌种[12-14]。我们的结果进一步证实AspergillussectionFlavi中A.flavus是主要致病菌种。此外，A.flavus也是伊朗地区慢性真菌性鼻窦炎的主要病原菌[15]。这可能是由于伊朗气候温暖，有利于黄曲霉等耐热真菌的生长。

根据新近分类，分子鉴定将A.minisclerotigenes归属于AspergillussectionFlavi，该菌种与A.flavus系统发育进化亲缘性相近[16]。基于NCBI Genbank数据库比对，本研究中CaM基因不能将A.minisclerotigenes与A.flavus分开，而BenA基因鉴定为A.minisclerotigenes，并进一步在荷兰真菌多样化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉专业数据库确认，由此说明多个基因位点联合鉴定可以更准确鉴定至菌种水平。伊朗学者Dehhan等[17]首次报道A.minisclerotigenes可引起人类感染。另一伊朗学者Esfahani等[18]报道1例由A.minisclerotigenes引起的真菌性角膜炎病例，建议许多的A.minisclerotigenes可能因基于形态学鉴定而被错误鉴定为黄曲霉，从而被忽视了。本研究首次报道A.minisclerotigenes为甲真菌病的病原菌。

由于A.flavus和A.oryzae分子序列相似度很高，CaM和BenA两个基因均不能将A.flavus与A.oryzae区分。因此，目前这两个菌种的鉴定主要依赖菌株来源和真菌毒素的产生而鉴别：A.oryzae通常在食物发酵和生物技术中广泛使用，不产生真菌毒素，而A.flavus产生黄曲霉毒素[19]，不用于食品加工。而 MALDI-TOF 质谱鉴定将本研究的指/趾甲分离38株A.flavus菌株正确鉴定，与Chang等[9]报道相同。MALDI-TOF质谱鉴定可将A.flavus与A.oryzae鉴别，可能是这两个菌种在氨基酸水平的差异。然而，MALDI-TOF质谱将1株A.minisclerotigenes错误鉴定为A.flavus，因本研究使用的MALDI-TOF质谱仪的真菌数据库未包含此少见的新菌种，说明MALDI-TOF质谱的准确菌种鉴定需要继续完善参考菌株数据库。我们的研究表明将分子鉴定和MALDI-TOF质谱两者结合能更准确鉴定曲霉属菌种。

体外抗真菌药敏实验结果表明特比萘芬(GM：0.03 mg/L，Modal MIC：0.03 mg/L，n=35)对AspergillussectionFlavi菌种具有良好的抗真菌活性，且抗菌活性明显高于唑类药物和两性霉素B。与既往研究结果相似[20-21]。而且已有许多研究报道特比萘芬在临床治疗曲霉引起的甲真菌病中具有良好的临床活性[3,22]。因此，特比萘芬可作为AspergillussectionFlavi所致甲真菌病的治疗选择。

黄曲霉的ECV值参照CLSI M61方案[23](泊沙康唑0.5 mg/L；伊曲康唑1 mg/L；伏立康唑1 mg/L；艾沙康唑1 mg/L和两性霉素B 4 mg/L)，本研究中所检测的5种唑类药物对38株A.flavus均具有良好的活性。其中泊沙康唑GM值最低(0.097 mg/L)，其次是伏立康唑和艾莎康唑(均为0.274 mg/L)，然后是伊曲康唑(0.311 mg/L)和雷伏康唑(0.394 mg/L)。虽然目前还没有雷伏康唑的流行病学临界值，我们的研究中发现所有的AspergillussectionFlavi菌株对雷伏康唑的MIC值(MIC 范围：0.25～0.5 mg/L)均小于1 mg/L，与Pfaller等[24]的研究结果相似。除此之外，两性霉素B对所有检测AspergillussectionFlavi菌株的MIC值均较高(GM：2.109 mg/L；MIC范围：1～4 mg/L)，其中有9株菌的MIC值为4 mg/L，与美国、欧洲以及中东地区先前的报道相似。本研究结果表明A.minisclerotigenes和A.flavus的体外抗真菌活性没有明显差异。

本研究中所检测的三个棘白菌素类抗真菌药物对所有AspergillussectionFlavi菌株均显示良好的活性，其中米卡芬净和阿尼芬净具有相似MIC值(MIC值范围为0.008～0.015 mg/L)，而卡泊芬净的MIC值范围为0.125～0.5 mg/L。与既往研究相似，表明米卡芬净和阿尼芬净比卡泊芬净敏感性高[20,25]。

根据分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定结果，表明在伊朗马什哈德地区AspergillussectionFlavi菌种中A.flavus是引起甲真菌病的最常见菌种。本文首次报道A.minisclerotigenes可作为甲真菌病的致病菌。建议分子测序联合MALDI-TOF质谱能更精准鉴定AspergillussectionFlavi到菌种水平。因不同的菌种对抗真菌药物的敏感性可能不同，正确鉴定曲霉至菌种水平对敏感药物的选择具有重要作用。除此之外，本研究结果表明特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素类药物是治疗AspergillussectionFlavi引起的甲真菌病的潜在有效药物，但其在体内的疗效有待进一步确定。